Improvement of the spectral design of fluorescence cystoscopy

Cancer of the urinary bladder is frequent in the Western world, it is the 4th most common malignancy among men, the 8th most frequent among women [Joch05]. The high rate of recurrence is the feature of bladder cancer that makes follow-up a crucial component in effective management, indeed it has the highest lifetime treatment costs per patient (pp) of all cancers [Siev09]. Interestingly, since several decades, endoscopic methods based on fluorescence imaging have been described. Both endogenous and exogenously-induced fluorescence have been investigated, leading to commercial products. Indeed porphyrin-based fluorescence cystoscopy is now commercialized. The thesis is divided into two projects in relation to two different concerns regarding the spectral design of fluorescence cystoscopy systems. PART I The aim of the present work is to optimize the spectral design of the instrumentation used to detect early superficial bladder cancer by fluorescence cystoscopy. This cancer photodetection approach is based on the use of Hexvix®, a precursor of fluorescing photoactivable porphyrins, such as protoporphyrin IX (PpIX), which are selectively produced in these lesions. This objective can potentially be reached by precisely selecting the fluorescence excitation and emission wavelengths producing the best Tumor/Normal tissues (T/N) contrasts and brightness. This optimization process must not only take in consideration the fluorescence spectroscopy of PpIX, which fluoresces in the red (between about 600 and 750 nm), but also that of the tissue autofluorescence, which fluoresces mostly in the green “450 – 600 nm” under violet (around 400 nm) excitation. Importantly, the luminescence produced by the bladder washout fluid (BWF) must be considered in this optimization process. Indeed, this luminescence, produced by the fluorochromes contained in the urine secreted by the patient during the cystoscopy, generates a “background” that degrades the quality of the fluorescence images. This effect is particularly important with systems that detect the green (450 – 600 nm) tissue autofluorescence to generate a so-called background image. This background image is used to reveal the texture of the bladder wall, whereas the foreground image presents the T/N contrast produced by the red PpIX fluorescence. Hence, a comprehensive analysis of the spectroscopy of this liquid will enable the identification of the optimal excitation and, possibly, detection wavelengths to be used to generate a minimal background and, consequently, an optimal contrast. It is also of interest to determine if simple approaches compatible with the clinic, like change of pH, variations of temperature, change of diet, can change the spectroscopy/intensity of this luminescence. Samples used for the fundamental spectroscopic analysis were the morning urines of seven volunteers, while samples of the BWF (tipically 15 ml) were collected during the drainage of the bladder of twenty-five patients. All the samples, either from patients either from volunteers, were analyzed with a spectrofluorimeter (LS-50B, Perkin Elmer, USA). The results are presented as assembled in an excitation-emission matrix (EEM), as well as fluorescence-emission spectra with excitation wavelengths ranging from 320 to 445 nm (5 nm steps) and emission wavelengths ranging from 350 nm to 800 nm. To identify the absorption features of the samples, an absorption spectrum between 300 nm and 800 nm was acquired with a spectrophotometer (Cary 500 UV/VIS/NIR, Varian, USA). A typical fluorescence spectrum of diluted urine shows a main peak (emission range between 420-440 nm and excitation range 320-340 nm) and sometimes a second peak (with emission ranged from 510 nm to 530 nm and excitation ranged from 445 nm to 465 nm). The fluorescence intensity as a function of urine concentration depicted two different patterns: one linear and one non-linear generally showing that the fluorescence intensity decreases with low urine concentrations. A threshold value, under which the fluorescence spectra were linear, was identified, and consequently only diluted samples spectra were acquired with the Perkin Elmer spectrofluorometer. The absorption spectra showed higher values of absorption with more concentrated samples and the absorption more important at low wavelengths (mainly in the blue). In this region of the spectrum it is also located the excitation peak of urine. This suggests that, while measuring the fluorescence intensity, in the excitation and emission paths light absorption takes place causing a bias in the resulting fluorescence measurements. Concerning the temperature and pH dependence a decrease of fluorescence was observed respectively increasing the temperature and increasing the pH, but it was not significant. Hence both approaches are not applicable in the clinics. Furthermore this study showed that the appearance of the second peak can be related to a high presence of riboflavin in urine. From the collection of urine after a period of vitamins intake we could observe that the second peak fluorescence was significantly affected. The results of how caffeine influence the urine fluorescence showed that the second peak fluorescence is clearly more marked in case of coffee consumption, and the absorption values are higher when the subjects drink coffee. Consequently one could potentially decrease the greenish blurring due to the BWF asking the patient to do not take vitamins, for example starting from three days before undergoing cystoscopy and ideally avoiding all the food that is high in Vitamin B2 and drinks high in caffeine. The analysis of the patients’ samples indicated that the shape of the fluorescence spectra are pretty much reproducible. The excitation and emission wavelengths of the fluorescence peaks that more affect the image visualization were identified. To optimize the spectral design of PDD systems a different and smaller excitation range can be chosen. Indeed decreasing the excitation range to 395 nm - 415 nm (instead of the current 370 nm – 430 nm), we would be able to detect lower contributions of the BWF fluorescence. PART II The second part of the thesis aimed to evaluate the possibility of detecting bladder carcinoma in situ (CIS) exploiting the green autofluorescence contrast. As a matter of fact CIS, which are corresponding to a poor prognosis, are frequently flat and difficult to detect during white light endoscopy. The main long-term goal of this work consists to assess if the decrease of the green autofluorescence, robustly observed in exophytic lesions, and their normal surrounding tissues is also present in flat CISs. If not, the detection of violet backscattered light to produce a background image is very likely to be more sensible since this background image is less degraded by the fluorescence produced by the bladder washout fluid. The purpose of the present study was to develop, validate and assess in a clinical context the use of an imaging system enabling to detect the light collected during endoscopy in specific spectral domains. The prototype used permitted to record four images in four distinct spectral ranges. The idea was to acquire the images on the same site during fluorescence cystoscopies performed at the Lausanne’s CHUV University Hospital. The first image was recorded through a standard long pass filter to have a classic PDD visualization of the bladder wall. The second image was obtained using a violet emission filter aiming to visualize the hemoglobin absorption peak. The last two images were detected using respectively a blue and a green emission filter aiming to determine if the T/N contrast detecting a background image in the violet is larger, equal or smaller than that obtained while detecting the green tissue autofluorescence. The images acquired during twelve cystoscopies were of relatively poor quality because of several factors. The presence of an additional optical element (the filter) in the optical path causes a defocusing effect, the image quality depended also on the operator self-training when positioning the cyscosope on the lesion and while keeping it fixed during the filters translation. Moreover the BWF frequently degraded the images, in particular those detecting the green tissue autofluorescence. However good quality images were obtained from two patients. These images showed an appreciable autofluorescence T/N contrast that was, for both suspected lesions, around 33%. Nevertheless the histopatologic examination of the suspected lesions demonstrated that they had an inflammatory origin only. Hence from the study arised that detecting the green autofluorescence, a contrast can be found in regions which are simply inflammations, thus producing a potential source of false-positives. Eventually performing this project allowed us to validate the suitability of the entire instrumentation in particular regarding the brightness of the images and to underly some of its critical aspects.

Il tumore della vescica è presente con un’alta incidenza nel mondo Occidentale, è il quarto tumore maligno più comune tra gli uomini e l’ottavo più frequente tra le donne [Joch05]. L’alto tasso di recidiva è la caratteristica del cancro alla vescica che rende il follow-up una componente cruciale nella sua gestione effettiva. Esso ha infatti i più alti costi di trattamento per paziente di tutti i cancri [Siev09]. E’ interessante notare che negli ultimi decenni sono stati studiati dei metodi endoscopici basati sull’imaging di fluorescenza; in particolare è stata esaminata sia la fluorescenza endogena che quella indotta esogenamente, portando alla commercializzazione di alcuni prodotti. La strumentazione per cistoscopia di fluorescenza basata su porfirina è, infatti, ora commercializzata. Per eseguire la cistoscopia di fluorescenza è necessario riempire la vescica con un liquido, tipicamente NaCl 0.9%, o Aqua. La soluzione composta da NaCl 0.9% o Aqua più urina è, ciò che viene definito liquido di lavaggio della vescica (LLV). La cistoscopia di fluorescenza è stata sviluppata per migliorare la diagnosi precoce del cancro alla vescica. Questa tecnica è eseguita utilizzando luce blu-viola (lunghezze d’onda di eccitazione tra 370 e 430 nm) per indurre la fluorescenza delle porfirine fotoattive, principalmente protoporfirina IX (PpIX). Quest’ultima è prodotta selettivamente nelle lesioni [Witj07] dopo l’istillazione nella vescica di un precursore (Hexvix®), tipicamente due ore prima dell’esame. L’immagine di fluorescenza risultante ha un colore blu-verde se il tessuto è sano mentre la lesione tumorale appare in rosso. Tuttavia durante la cistoscopia di fluorescenza con sistemi di diagnosi fotodinamica (PDD), si osserva che le immagini acquisite sono in qualche maniera sfuocate da una luminescenza verdastra che ha origine dal sopra citato LLV. Anche se questa perturbazione è osservabile con tutti i sistemi PDD disponibili sul mercato, tale luminescenza è più visibile con quei sistemi che, per creare l’immagine di fondo, rilevano l’emissione nel verde anzicchè rilevare la luce retrodiffusa blu-viola. Un altro aspetto importante riguarda l'individuazione dei carcinomi in situ (CIS), lesioni tumorali potenzialmente aggressive per la loro natura non prevedibile e di difficile detezione con i metodi convenzionali. Questo lavoro di tesi è stato, perciò, focalizzato sulla realizzazione di due obiettivi relativi alla progettazione spettrale dei sistemi di cistoscopia di fluorescenza: l’ottimizzazione spettrale della strumentazione, finalizzata a migliorare la detezione delle lesioni superficiali della vescica superando quindi il limite dovuto alla fluorescenza del LLV e la valutazione delle potenzialità di questa tecnica nella rilevazione dei carcinoma in situ sfruttando il contrasto dell’autofluorescenza nella regione spettrale del verde. PARTE I L’obiettivo della prima parte del presente lavoro è di migliorare da un punto di vista spettrale la strumentazione utilizzata per la detezione precoce di lesioni tumorali superficiali della vescica. Questo processo di ottimizzazione deve prendere in considerazione non solo la spettroscopia di fluorescenza della PpIX, che emette fluorescenza nel rosso (tra circa 600 e 750 nm), ma anche l’autofluorescenza tissutale, che emette fluorescenza principalmente nel verde (450-600 nm) per mezzo di una luce di eccitazione viola (a circa 400 nm). Fondamentalmente nel processo di ottimizzazione va considerata la luminescenza prodotta dal liquido di lavaggio della vescica. Infatti, questa luminescenza, prodotta dai fluorocromi presenti nell’urina secreta dal paziente durante la cistoscopia, genera un “background” che degrada la qualità delle immagini di fluorescenza. Per questo motivo, un’analisi completa di tale liquido consentirà l’identificazione delle lunghezze d’onda ottimali di eccitazione e, eventualmente, di detezione da utilizzare per generare il minimo background e quindi, un contrasto ottimale. Un altro aspetto di interesse è quello di determinare se semplici approcci, compatibili con la procedura clinica, come variazioni di pH, di temperatura, o modifiche nella dieta, possono cambiare l’ intensità di tale luminescenza. I campioni utilizzati per l’analisi spettroscopica di base sono stati le urine mattutine di sette volontari, mentre i campioni di liquido di lavaggio della vescica (tipicamente 15 ml) sono stati raccolti durante il drenaggio della vescica di venticinque pazienti. Tutti i campioni, sia quelli provenienti dai volontari che quelli provenienti dai pazienti sono stati analizzati per mezzo di uno spettrofluorimetro (LS-50B, Perkin Elmer, USA). I risultati sono presentati in matrici di eccitazione-emissione (EEM) e in spettri di emissione di fluorescenza con lunghezze d’onda di eccitazione da 320 a 445 nm (con step di 5 nm) e lunghezze d’onda di emissione da 350 nm a 800 nm. Per identificare le caratteristiche di assorbimento dei campioni, sono stati acquisiti anche spettri di assorbimento tra 300 e 800 nm mediante un spettrofotometro (Cary 500 UV/VIS/NIR, Varian, USA). Un tipico spettro di fluorescenza di urina diluita con NaCl (0.9%, B. Braun, Germany) presenta un picco principale con range di emissione tra 420 e 440 nm (range di eccitazione tra 320 e 340 nm) e, alcune volte, un secondo picco con range di emissione 510-530 nm( range di eccitazione 445-465 nm). L’intensità di fluorescenza in funzione della concentrazione di urina ha messo in evidenza due diversi andamenti: uno lineare e uno non lineare, mostrando comunque che l’intensità di fluorescenza diminuisce con basse concentrazioni di urina. Conseguentemente a tali risultati, è stato identificato un valore di soglia, sotto il quale gli spettri di fluorescenza erano lineari, e successivamente sono stati analizzati con lo spettrofluorimetro Perkin-Elmer, soltanto campioni diluiti di urina. Gli spettri di assorbimento hanno invece mostrato più elevati valori di assorbimento con campioni più concentrati e un assorbimento più importante a lunghezze d’onda corte (principalmente nel blu). In questa stessa regione spettrale si trova anche il picco di eccitazione dell’urina. Ciò suggerisce che, durante la misura di fluorescenza, sia presente un assorbimento della luce nei cammini di eccitazione e di emissione, che di conseguenza causa un errore nelle risultanti misure di fluorescenza. Per quanto riguarda le variazioni di pH e di temperatura, è stata osservata una diminuizione della fluorescenza al crescere rispettivamente di pH e temperatura; tuttavia tale diminuizione non risulta essere significativa. Perciò entrambi gli approcci non hanno una applicabilità nella procedura clinica. Questo studio ha, inoltre, mostrato che la comparsa del secondo picco di fluorescenza può essere legata a una notevole presenza di vitamina B2 nelle urine, la riboflavina. Analizzando campioni di urina di un volontario dopo l’assunzione di compresse multivitaminiche, è stato infatti possibile osservare che il secondo picco di fluorescenza subisce particolarmente l’influenza di tale assunzione. In aggiunta, i risultati circa l’influenza della caffeina sulla fluorescenza dell’urina, hanno fatto constatare che il secondo picco è chiaramente più marcato in caso di assunzione di caffè così come anche i valori di assorbimento sono maggiori in queste condizioni. Alla luce di questi risultati, si può pensare di ottenere una riduzione dell’effetto di sfuocamento dovuto alla fluorescenza del liquido di lavaggio della vescica, chiedendo per esempio al paziente di non assumere vitamine, a partire da tre giorni prima dell’intervento e di evitare idealmente alimenti ricchi di vitamina B2 e bevande ad alto contenuto di caffeina. L’analisi dei campioni di liquido di lavaggio della vescica ha indicato che la forma degli spettri di fluorescenza è più o meno riproducibile tra i vari pazienti ed è stato possibile identificare le lunghezze d’onda di eccitazione e emissione dei picchi di fluorescenza che più influenzano la visualizzazione delle immagini. Per questo motivo lo studio ha condotto alla determinazione di un diverso intervallo di lunghezze d’onda di eccitazione che può essere scelto per ottimizzare i sistemi di diagnosi fotodinamica. Infatti, diminuendo l’intervallo di eccitazione a 395-415 nm (invece dell’attuale 370-430 nm) si può ottenere un minor contributo della fluorescenza del liquido di lavaggio della vescica, rendendo l’immagine più nitida e di migliore visualizzazione. PARTE II L’obiettivo della seconda parte del lavoro di tesi è stato di valutare la possibilità di rilevare i carcinoma in situ sfruttando il contrasto dell’autofluorescenza nella regione spettrale del verde. Infatti, i CIS, che corrispondono a uno scarso livello di prognosi, sono frequentemente lesioni piatte e difficili da diagnosticare durante endoscopia con luce bianca. La finalità a lungo termine di questo studio consiste nel valutare se la riduzione dell’autofluorescenza nel verde, efficacemente osservata nelle lesioni esofitiche e nei loro tessuti sani circostanti, è anche presente nei CIS. In caso contrario, è probabile che sia più efficace la detezione di luce viola retrodiffusa per produrre l’ immagine di sfondo (anzicchè l’autofluorescenza verde) in quanto questa immagine di sfondo verrebbe meno degradata dalla fluorescenza del liquido di lavaggio della vescica. Lo scopo di questa sezione di tesi è stato dunque di sviluppare, validare e stimare l’utilizzo in un contesto clinico, di un sistema di imaging in grado di rilevare la luce raccolta durante endoscopia in differenti intervalli spettrali. Il prototipo utilizzato ha permesso di registrare quattro immagini in quattro diversi domini spettrali. L’idea è stata di acquisire immagini della stessa area durante cistoscopie di fluorescenza eseguite nell’Ospedale Universitario CHUV di Losanna (Svizzera). La prima immagine è stata acquisita attraverso un filtro standard passa alto in modo da ottenere una visualizzazione classica, in modalità PDD (photodynamic diagnosis), delle pareti vescicali. La seconda immagine è stata ottenuta utilizzando un filtro viola di emissione con lo scopo di visualizzare il picco di assorbimento dell’emoglobina. Infatti, essendo i tessuti tumorali maggiormente vascolarizzati, si dovrebbe essere in grado di osservare il contrasto tra lesione (maggiore assorbimento da parte dell’emoglobina) e tessuto sano (minore assorbimento da parte dell’emoglobina). Infine, le utime due immagini sono state rilevate utilizzando rispettivamente filtri di emissione blu e verde; questo per determinare se il contrasto T/N, rilevando l’immagine di fondo nel blu-viola, è maggiore, uguale o minore di quello ottenuto rilevando l’immagine verde di autofluorescenza del tessuto. Le immagini acquisite nel corso di dodici cistoscopie sono state di qualità relativamente bassa a causa di diversi fattori. La presenza di un elemento ottico addizionale (il filtro) nel cammino ottico ha causato un effetto di sfuocamento; la qualità dell’immagine è stata anche influenzata dall’insufficiente preparazione del medico operatore nel posizionare il cistoscopio sulla lesione sospetta e nel tenerlo fisso durante la traslazione dei filtri. Inoltre il liquido di lavaggio della vescica ha spesso degradato le immagini, in particolar modo quelle rilevanti l’autofluorescenza tissutale verde. Tuttavia sono state ottenute immagini di buona qualità durante la cistoscopia di fluorescenza di due pazienti. Lo studio di queste immagini ha mostrato un apprezzabile contrasto T/N in termini di autofluorescenza arrivando, in entrambe le lesioni sospette, a un valore di circa 33%. Dai risultati istopatologici è però risultato che le due lesioni sospette avevano un’ origine soltanto infiammatoria. In conclusione dallo studio è emerso che rilevando l’autofluorescenza nel verde è possibile riscontrare un contrasto in regioni che sono semplicemente infiammazioni, producendo così una potenziale fonte di falsi positivi. Infine lo svolgimento di questo progetto ci ha permesso di validare l’idoneità dell’intera strumentazione, in particolare per quanto riguarda la luminosità delle immagini e, nello stesso tempo, ci ha consentito di mettere in rilievo delle criticità che possono essere affrontate negli studi futuri.