Design, fabrication and experimental validation of a system for cell unsteady flow interaction studies

The aim of this work is to design, fabricate and validate a system able to perform unsteady patterns of flow, to studies endothelial cells response. In fact pulsatile low-average and oscillatory shear stress are considered critical fluid dynamic conditions for the development of atherosclerotic lesions. The working principle of the device is based on a compressed gas exploited as actuator to move the working fluid (cells growth medium). Two closed reservoirs partially filled with fluid are connected to the flow chamber where the culture cells are placed. Each reservoir has an input valve to connect it with the compressed gas and an output valve to communicate with external environment. Controlling the pressure of the gas inside the reservoirs (acting on the opening function of the valves) we can control the flow rate and waveform which flows through the system and thus in the flow chamber. For the design step a dynamic model of the system with a lumped-parameter approach is implemented. Therefore also computational fluid dynamic studies (CFD) are performed. The commercial software used are Simulink and STAR-CCM+. The aim of this step is to verify the feasibility of the system and to obtain indication for the choice of device components. The second step is the setup fabrication. All the component are chosen or manufactured, characterised and assembled. In this step also a flow feedback controller and an automatic system to regulate the temperature are implemented. After the fabrication the setup is validated. We explore its maximum operation range: using air relative supply pressure up to 2 bar it is possible to reach an oscillatory flow rate with amplitude up to 250ml/min (corresponding for our flow chamber at 11.67 Pa of shear stress) with frequency up to 3 Hz; up to 110 ml/min (5.13 Pa) with frequency up to 5 Hz. The setup is also validated with cells experiments: we stimulate six samples of HUVECS cells with oscillatory shear stress with 1.4 Pa as amplitude and a frequency from 1 to 6 Hz. The experiments confirm the biocompatibility of the system: cells are alive, vital and attached to the substrate. The samples are then analysed with immunostaining techniques. From these first results a frequency response of the cells is supposable. However further experiments are necessary to enhance the comprehension of the strict correlation between the mechanics of unsteady flow with biological response of the vessel wall cells. This will be the central aim of the research project that will be developed exploiting the device realized in this work, which feasibility and biocompatibility is here demonstrated.

L’obiettivo del presente lavoro è quello di progettare, realizzare e validare un dispositivo in grado di generare flussi variabili per la stimolazione delle cellule endoteliali. E’ noto, infatti, che le condizioni fluidodinamiche maggiormente aterogeniche in vivo sono costituite da uno sforzo di taglio pulsatile con un basso flusso netto o oscillatorio (flusso netto nullo). Il principio di funzionamento del dispositivo è basato su un gas compresso che agisce come attuatore per muovere il fluido di lavoro (mezzo per colture cellulari). Due reservoir chiusi parzialmente e riempiti con il fluido sono connessi alla camera di flusso, dove sono situate le cellule. Ogni reservoir è connesso alla bombola del gas pressurizzato tramite una valvola di input e all’ambiente esterno tramite una valvola di output. Agendo sulla funzione d’apertura delle valvole si può controllare la pressione all’interno del reservoir e, di conseguenza, la portata e la forma d’onda del flusso di fluido nella camera. Per la fase di progettazione è implementato un modello dinamico del sistema, a parametri concentrati per studiare la fattibilità del sistema e l’influenza della variazione dei parametri di lavoro sulle variabili di interesse (flusso e sforzo di taglio sulle cellule). Al modello dinamico sono abbinati anche degli studi di fluidodinamica computazionale (CFD). Oltre alla fattibilità del sistema in questa fase si ricavano anche indicazioni per le componenti del setup sperimentale. La seconda fase prevede la realizzazione del sistema sperimentale. Tutti i componenti necessari sono scelti o fabbricati, caratterizzati e assemblati. In questa fase è implementato, inoltre, un controllore a fededback per il flusso e un sistema di regolazione della temperatura. Il dispositivo è, infine, validato. Dapprima ne viene testato il range di funzionamento. Utilizzando fino a 2 bar di pressione relativa a monte delle valvole, il sistema può garantire un flusso oscillatorio fino a 250 ml/min (corrispondenti a 11.67 Pa con la camera di flusso utilizzata) con frequenza fino a 3 Hz e fino a 110 ml/min (5.13 Pa) con frequenza fino a 5 Hz. Il dispositivo è validato anche dal punto di vista biologico, tramite esperimenti cellulari. Sei campioni di cellule HUVEC vengono stimolati con uno sforzo di taglio oscillatorio con ampiezza 1.4 Pa e frequenza da 1 a 6 Hz. I campioni sono poi analizzati con tecniche di immunostaining. Dai primi risultati emerge una possibile correlazione tra la frequenza di stimolazione e la risposta cellulare. Tuttavia saranno necessari ulteriori esperimenti per migliorare la comprensione della stretta correlazione tra gli effetti meccanici del flusso non stazionario e la risposta biologica delle cellule endoteliali. Questo sarà proprio lo scopo su cui si focalizzerà il progetto di ricerca che sfrutterà il dispositivo qui descritto, la cui fattibilità e biocompatibilità vengono qui dimostrate.