A fluorinated branched dendrimer as promising miRNA carrier in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) murine in vitro models

In recent years, gene therapy has been gaining increasing interest in the field of nanomedicine as the use of nucleic acids as therapeutic agents to modulate gene expression represents a promising strategy for the treatment of genetic disorders. Among genetic disorders, one of the most critical is amyotrophic lateral sclerosis, a progressive and fatal neurodegenerative disease that is known to be linked to mutations of specific genes, such as superoxide dismutase (SOD1). Studies have highlighted how in cells, in response to the damages caused by the disease, there is an intrinsic compensatory reaction, which is related to the upregulation of specific microRNAs (miRNAs). Yet, this reaction is insufficient and gene therapy could play a key role in helping the process. However, the delivery of nucleic acids (NAs) inside the cell is a challenging task. The need of achieving an adequate NAs intracellular delivery requires the use of gene delivery vectors, which are vehicles faciliting the NA intracellular internalization, while protecting it from degradation. In particular, cationic lipids and polymers represent a promising category of vectors; thanks to their positive charge, these molecules are able to interact with the anionic phosphate groups of nucleic acids forming complexes. Among polymeric agents, cationic dendrimers have been widely used in gene delivery and functionalization with fluorinated moieties is reported to be an efficient way to increase transfection efficiency. In this context, researchers of SupraBioNanoLab of Politecnico di Milano and Neurological Institute Foundation “Carlo Besta” developed a new gene delivery vector consisting of II generation fluorinated Janus-type dendrimer carrying four primary ammonium groups (FJD2N) at the hydrophilic periphery and 27 equivalent fluorine atoms as the hydrophobic part. Previous studies revealed that FJD2N is able to transfect miRNA in ependymal progenitor/stem cells with reduced cytotoxicity and increased efficiency when compared to commercially available non-viral vector. With the scope of studying the versatility of FJDNs as gene delivery vectors, this master thesis project focuses on the treatment of ALS acting on the muscular system, with the aim of finding a new gene delivery therapy against the disease. In this regard, we expanded the family of FJDNs by synthetizing the I generation FJDN (FJD1N). The first part of the project is focused on the study of the self-assembling properties of FJD1N in aqueous media in comparison with those observed for the already characterised FJD2N. Overall, FJD1N is dispersible in aqueous media, but it forms less stable and larger aggregates than FJD2N, which eventually precipitate. Colloidal unstable self-assembling systems are not suitable candidates for gene delivery applications. The second part of this work is focused on testing the transfection efficiency in vitro on myoblasts derived from G93A-SOD1 mice using dendriplexes formed by FJD2N with microRNA 206 (miR-206), a myogenic miRNA related to muscle regeneration and differentiation. The results showed expression levels of miRNA 206 and of some of its target genes confirming the successful internalization of miR-206 and also its ability to modulate the expression levels of its target genes. These results definitely proved the versatility of FJD2N as promising carrier for intracellular miRNA delivery.

Negli ultimi anni, la terapia genica sta guadagnando un crescente interesse nel campo della nanomedicina, poiché l'uso di acidi nucleici come agenti terapeutici per modulare l'espressione genica rappresenta una strategia promettente per il trattamento delle malattie genetiche. Tra queste, una delle più critiche è la sclerosi laterale amiotrofica, una malattia neurodegenerativa progressiva e fatale, nota per essere legata a mutazioni di geni specifici, come la superossido dismutasi (SOD1). Gli studi hanno evidenziato come nelle cellule, in risposta ai danni causati dalla malattia, vi sia una reazione compensatoria intrinseca, associata all'upregolazione di specifici microRNA (miRNA). Tuttavia, questa reazione è insufficiente e la terapia genica potrebbe svolgere un ruolo chiave nell’assistere questo processo. Il trasporto degli acidi nucleici all'interno della cellula non è un compito facile. La necessità di ottenere un trasporto adeguato ha portato alla nascita di diverse strategie, come l'uso di vettori, ovvero di veicoli in grado di consegnare l'acido nucleico al sito desiderato proteggendolo dalla degradazione. In particolare, i lipidi e i polimeri cationici rappresentano una promettente categoria di vettori: grazie alla loro carica positiva, queste molecole sono in grado di interagire con i gruppi fosfato anionici degli acidi nucleici formando dei complessi. I dendrimeri cationici sono ampiamente studiati per potenziali applicazioni nella veicolazione genica e la funzionalizzazione con ligandi fluorurati risulta essere un modo efficace per aumentare l'efficienza di trasfezione. In questo contesto, i ricercatori del SupraBioNanoLab del Politecnico di Milano e della Fondazione Istituto Neurologico "Carlo Besta" hanno sviluppato un nuovo vettore di trasporto genico costituito da un dendrimero fluorurato di tipo Janus di II generazione (FJD2N) con quattro gruppi ammonio primari nella porzione idrofila e 27 atomi di fluoro equivalenti come porzione idrofobica. Studi precedenti hanno rivelato che FJD2N è in grado di trasfettare microRNA in cellule progenitrici/staminali ependimali, con una minore citotossicità e maggiore efficienza se confrontato con i vettori non virali disponibili in commercio. Con l'obiettivo di studiare la versatilità dei dendrimeri cationici fluorurati di tipo Janus (FJDNs) come vettori di trasporto genico, questo progetto di tesi di laurea magistrale si concentra sul trattamento della SLA agendo sul sistema muscolare, con l'obiettivo di trovare una nuova terapia di trasporto genico contro la malattia. A questo proposito, la famiglia dei FJDN è stata espansa sintetizzando il derivato di I generazione (FJD1N). La prima parte del progetto è incentrata sullo studio delle proprietà di self-assembly di FJD1N in mezzi acquosi, confrontandole con quelle osservate per il già caratterizzato FJD2N. I risultati hanno mostrato che FJD1N è disperdibile in mezzi acquosi, ma forma aggregati più grandi e meno stabili di FJD2N, che non sono utilizzabili come agenti di trasfezione. Per questi motivi, abbiamo deciso di utilizzare FJD2N come vettore per i test biologici. La seconda parte di questo lavoro mostra i risultati di esperimenti di trasfezione condotti in vitro su mioblasti derivanti da topi G93A-SOD1 utilizzando dendriplessi formati da FJD2N e dal microRNA 206 (miR-206), un miRNA miogenico legato alla rigenerazione e al differenziamento muscolare. I livelli di espressione del miR-206 e di alcuni dei suoi geni bersaglio hanno confermato che FJD2N è in grado di trasportare e rilasciare con successo nei mioblasti il miRNA veicolato, modulando i livelli di espressione dei suoi geni bersaglio e dimostrando dunque come FJD2N sia un vettore versatile e promettente per applicazioni di terapia genica.