pH-sensitive tracers for fluorescence-guided glioblastoma surgery

Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most common primary brain cancers, corresponding to approximately 17% of all diagnosed tumours. Unfortunately, it is characterized by a high recurrence rate also because the supporting cells of the brain facilitate cancer proliferation. Since ordinary therapies to cure GBM are not available yet, surgical resection represents the first crucial step of the treatment to limit cancer relapse. Considering that during nervous system surgery each volume additionally removed can be associated with serious consequences for the preservation of patients’ brain function, several measures are currently used to make the tumour resection as precisely as possible. In this perspective, some of the recent advances involve the fluorescent intraoperative navigation. Among the several investigated fluorophores, Fluorescein has become one of the most ubiquitous probes in biological studies and it is already used in clinical practice thanks to its intense fluorescence, chemical stability, and lack of cytotoxicity at working concentrations. However, its most important limitation is the lack of specificity for cancer cells. Therefore, this project aims to develop a specific fluorescent tracer able to more selectively label cancer cells during glioblastoma surgical resection. Specifically, we focused on targeting the acidic tumor microenvironment by exploiting the pH-sensitive properties of pH (low) insertion peptides (pHLIPs). Being moderately hydrophobic, pHLIPs have a modest affinity for cellular membranes at physiological pH, but fold and insert across the phospholipid bilayer only at low pH, allowing them to sense pH at the surfaces of cells in diseased tissues, where it is lower. In this study, pHLIPs were directly conjugated to a Fluorescein-maleimide derivative (FL-pHLIP) in order to be employed as fluorescent imaging agents. To evaluate the behavior of this novel system and verify that the FL-linkage did not affect the pH-dependent membranes insertion, we characterized both Wild Type (WT) and FL- pHLIPs from a chemical-physical perspective. The results on peptide stability and self-assembly are reported together with a study of pHLIP interaction with model systems of the cellular membrane, such as liposomes and supported lipid bilayers (SLBs). Finally, FL-pHLIP labelling efficiency and cytotoxicity were assessed by in vitro cellular tests performed on three different lines of patient-derived glioblastoma primary cells in collaboration with Dr. Serena Pellegatta from Carlo Besta Neurological Institute. Results show encouraging and effective specific targeting of proliferative and mesenchymal subtypes of primary glioblastoma cells.

Il glioblastoma multiforme (GBM) è uno dei tumori cerebrali primari più comuni, corrispondente a circa il 17% di tutti i tumori diagnosticati. Sfortunatamente, è caratterizzato da un alto tasso di recidiva, anche perché le cellule del cervello facilitano la proliferazione del cancro. Poiché terapie ordinarie per curare il GBM non sono ancora disponibili, la resezione chirurgica rappresenta il primo passo cruciale del trattamento per limitare la recidiva del tumore. Considerando che durante la chirurgia del sistema nervoso ogni volume aggiuntivo rimosso può essere associato a gravi conseguenze per la conservazione della funzione cerebrale dei pazienti, diverse misure vengono attualmente utilizzate per rendere la resezione del tumore il più precisa possibile. In questa prospettiva, alcuni dei recenti progressi riguardano la navigazione intraoperatoria fluorescente. Tra i numerosi fluorofori studiati, la Fluoresceina è diventata una delle sonde più presenti negli studi biologici ed è già utilizzata in clinica grazie alla sua intensa fluorescenza, stabilità chimica e mancanza di citotossicità alle concentrazioni di lavoro. Tuttavia, la sua limitazione più importante è la mancanza di specificità per le cellule tumorali. Pertanto, questo progetto ha lo scopo di sviluppare un tracciante fluorescente specifico in grado di marcare in modo più selettivo le cellule tumorali durante la resezione chirurgica del glioblastoma. Nello specifico, ci siamo concentrati sull’individuare il microambiente tumorale acido sfruttando le proprietà sensibili al pH di peptidi pHLIP (pH low insertion peptides). Essendo moderatamente idrofobici, i pHLIP hanno una modesta affinità per le membrane cellulari a pH normale, ma si piegano e si inseriscono attraverso il doppio strato fosfolipidico solo in ambiente acido, consentendo loro di percepire il pH sulla superficie delle cellule nei tessuti malati, dove è più basso. In questo studio, i pHLIP sono stati direttamente coniugati a un derivato della Fluoresceina-maleimide (FL-pHLIP) per essere impiegati come agenti di imaging fluorescenti. Per valutare il comportamento di questo nuovo sistema e verificare che il legame con il fluoroforo non influenzi l'inserimento pH-dipendente nelle membrane, abbiamo caratterizzato sia Wild Type (WT) che FL- pHLIPs da una prospettiva chimico-fisica. I risultati sulla stabilità e il self-assembly dei peptidi sono riportati insieme a uno studio sull'interazione dei pHLIP con sistemi modello di membrana cellulare, come liposomi e doppi strati lipidici supportati (SLB). Infine, l'efficienza di marcatura e la citotossicità dei peptidi FL-pHLIP sono state valutate mediante test cellulari in vitro eseguiti su tre diverse linee di cellule primarie di glioblastoma derivate da pazienti in collaborazione con la Dott.ssa Serena Pellegatta dell'Istituto Neurologico Carlo Besta. I risultati mostrano un incoraggiante ed efficace targeting specifico dei sottotipi proliferativi e mesenchimali delle linee cellulari.