Deep eutectic solvents : new tools for biomass valorization

In this PhD thesis, deep eutectic solvents (DESs) were investigated as new tools for biomasses valorization thanks to their versatility and unique properties. DESs are easily prepared by mixing together a hydrogen bond donor (HBD) and a hydrogen bond acceptor (HBA) at high temperatures (50-100 °C) for few hours. Frequently HBA and HBD are natural compounds, leading to the classification of these DESs as natural DESs (NADESs). For many years, DESs were considered similar to ionic liquids (ILs) as “new green solvents”, but recently DESs have gained more relevance because they offer some advantages over ILs, such as no-toxicity, biocompatibility, biodegradability and cost-effectiveness. Consequently, DESs are largely exploited in many fields, such as biocatalysis, biomass fractionation, CO2 capture and metallurgy. However, despite their widespread exploitation, the scientific community is highly debating about what can be considered a DES and what a simple mixture of compounds, which are the main parameters to consider in the definition of a DES and how the presence of water influences the DES formation. In fact, the term “DES” is often abused because of the limited number of publications devoted to understand DESs nature, and the absence of a standardized, cost-effective method for their characterization. For this reason, we set up a new analytical tool based on the NMR technique for the study of trimethylglycine betaine-based DESs. In particular we focused on understanding how the relaxation time (T1) of this set of DESs changes with the HBD molar fraction, and how this correlation might be modified by progressive additions of water. The first DESs application here reported involves their utilization in the biocatalytic synthesis of polar head-modified phospholipids. In particular DESs in biocatalysis are known to work as co-solvents with water, as pure solvents or as solvent and substrate of the reaction. In the latter case, these DESs are referred to as reactive DESs (RDESs), and we exploited them for the enzymatic transphosphatidylation of phosphatidylcholine (PC). PC is the most abundant natural phospholipid and is esterified at sn-1 and sn-2 positions with saturated and unsaturated long chain fatty acids, which constitute the lipophilic moieties, and in sn-3 with a phosphate diester as the polar head group. In particular, the enzyme phospholipase D (PLD) catalyzes the transphosphatidylation of the substrate in presence of an alcohol (X-OH) leading to PX formation. So, in this work, we investigated the potentialities of alcohol-based RDESs for the enzymatic transformation of PC into two polar head-modified phospholipids of pharmaceutical interest, phosphatidylglycerol (PG) and phosphatidylethyleneglycol (P-EG). The second application addressed has been the set-up of a multistep DES-mediated process to fractionate two abundant regional agrifood wastes biomasses: brewers’ spent grain (BSG) and rice husks (RHs). The primary objective was the recovery and exploitation of their main fractions, with a particular attention focused on recovered lignins. In detail, the developed process was based on an initial biomass pretreatment in hot water in autoclave that led to the formation of a soluble fraction and of an insoluble one. For BSG, the soluble fraction (accounting for 25% of the initial biomass) consisted in sugars subsequently exploited for the preparation of growth media for microbial fermentation, instead, in RHs cases, we recovered by extraction phenyl-propanoids (2-3%). For all biomasses, after filtration, the insoluble fraction was successively submitted to a DES-mediated fractionation process, which allowed the recovery of the cellulose-enriched fraction and the lignin. The recovered lignin fractions (almost 15-20% of the initial biomass) have been deeply characterized, and a preliminary evaluation of their potentiality as precursors of cement water reducers gave encouraging results. The studies on lignin recovery from waste biomasses led more recently to exploit this material for nanoparticles (NPs) preparation in the third part of the PhD work. Initially, the set-up of the NPs synthesis protocol using the technical lignin Protobind has been studied thanks to its quite low cost and large availability in research laboratory. The final aim of this work was the set-up of a sustainable scaffold for enzyme immobilization that could be employed in phospholipids biotransformations. In particular, stable lignin nanoparticles were synthetized starting from hydroxymethylated lignin, and then PLD was immobilized on them by direct adsorption without use of any crosslinkers. The immobilized PLD was employed in the biotransformation of PC in three natural high-value polar head-modified phospholipids: phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylserine (PS) and phosphatidylethanolamine (PE).

In questa tesi di dottorato, i deep eutectic solvents (DES) sono stati studiati come nuovi strumenti per la valorizzazione di biomasse grazie alla loro versatilità e interessanti proprietà. I DES sono facilmente preparati mescolando insieme un donatore di legame a idrogeno (HBD) e un accettore di legame a idrogeno (HBA) a temperature elevate (50-100 °C) per poche ore. Spesso HBA e HBD sono composti naturali, il che classifica questi solventi come naturali (NADES). Per molti anni, i DES sono stati considerati simili ai liquidi ionici (IL) come "nuovi solventi ecologici", ma recentemente hanno guadagnato maggiore rilevanza in quanto offrono alcuni vantaggi rispetto agli IL, come la non tossicità, la biocompatibilità, la biodegradabilità e la convenienza economica. Di conseguenza, i DES sono ampiamente utilizzati in molti campi, come la biocatalisi, il frazionamento di biomasse, la cattura di CO2 e la metallurgia. Tuttavia, nonostante la loro diffusa utilizzazione, la comunità scientifica si domanda cosa possa essere considerato un DES e cosa una semplice miscela di composti, quali sono i principali parametri da considerare nella definizione di un DES e come la presenza di acqua influisce sulla loro formazione . Infatti, il termine "DES" viene spesso abusato a causa del numero limitato di pubblicazioni dedicate alla comprensione della loro natura e all'assenza di un metodo standardizzato ed economico per la loro caratterizzazione. Per questo motivo, abbiamo sviluppato uno strumento analitico basato sulla tecnica della risonanza magnetica nucleare (NMR) per lo studio dei DES a base di trimetilglicina betaína. In particolare, ci siamo concentrati sulla comprensione di come il tempo di rilassamento (T1) di questo insieme di DES cambi con la frazione molare di HBD e come questa correlazione potrebbe essere modificata dalle progressive aggiunte di acqua. La prima applicazione dei DES qui riportata riguarda il loro utilizzo nella sintesi biocatalitica di fosfolipidi con testa polare modificata. In particolare, è noto che i DES in biocatalisi possono funzionare come co-solventi con acqua, come solventi puri o come solventi e substrato della reazione. In quest'ultimo caso, questi DES sono definiti DES reattivi (RDES), e li abbiamo sfruttati per la transfosfatidilazione enzimatica del fosfatidilcolina (PC). La PC è il fosfolipide naturale più abbondante ed è esterificato in posizione sn-1 e sn-2 con acidi grassi a catena lunga saturi e insaturi, che costituiscono le parti lipofile, e in posizione sn-3 con un diestere fosfato come gruppo polare. In particolare, l'enzima fosfolipasi D (PLD) catalizza la transfosfatidilazione del substrato in presenza di un alcol (X-OH), portando alla formazione di PX. Quindi, in questo lavoro, abbiamo studiato le potenzialità dei RDES a base di alcol per la trasformazione enzimatica del PC in due fosfolipidi con testa polare modificata di interesse farmaceutico, fosfatidilglicerolo (PG) e fosfatidiletilen glicole (P-EG). La seconda applicazione affrontata riguarda la messa a punto di un processo multistep basata sull'utilizzo dei DES per il frazionamento di due biomasse agroalimentari abbondanti in Lombardia: le trebbie di birra (BSG) e la lolla di riso (RH). L'obiettivo principale era il recupero e l'utilizzo delle loro principali frazioni, con particolare attenzione a quella di lignina. Nel dettaglio, il processo sviluppato si basa su un pretrattamento iniziale della biomassa in acqua calda in autoclave, che porta alla formazione di una frazione solubile e di una frazione insolubile. Nel caso del BSG, la frazione solubile (corrispondente al 25% della biomassa iniziale) consisteva in zuccheri successivamente utilizzati per la preparazione di terreni di coltura per la fermentazione microbica, mentre nel caso delle RH, sono state recuperate sostanze fenilpropanoidi (2-3%). Per entrambe le biomasse, dopo la filtrazione, la frazione insolubile è stata successivamente sottoposta a un processo di frazionamento mediato dai DES, che ha permesso il recupero della frazione arricchita di cellulosa e della lignina. Le frazioni di lignina recuperate (quasi il 15-20% della biomassa iniziale) sono state ampiamente caratterizzate, e una valutazione preliminare delle loro potenzialità come precursori di riduttori d'acqua per il cemento ha dato risultati incoraggianti. Gli studi sul recupero della lignina dalle biomasse di scarto hanno portato più recentemente all'utilizzo di questo materiale per la preparazione di nanoparticelle (NPs) nella terza parte del lavoro di dottorato. Inizialmente, è stato studiato il protocollo di sintesi delle NPs utilizzando la lignina tecnica Protobind, grazie al suo costo relativamente basso e alla sua ampia disponibilità nei laboratori di ricerca. L'obiettivo finale di questo lavoro era la messa a punto di una struttura sostenibile per l'immobilizzazione degli enzimi che potesse essere impiegata nelle biotrasformazioni dei fosfolipidi. In particolare, sono state sintetizzate nanoparticelle di lignina stabili a partire da lignina idrossimetilata, e quindi la PLD è stata immobilizzata su di esse per adsorbimento diretto senza l'uso di crosslinker. La PLD immobilizzata è stata impiegata nella biotrasformazione del PC in tre fosfolipidi naturali di alto valore con testa polare modificata: fosfatidilglicerolo (PG), fosfatidilserina (PS) e fosfatidiletanolamina (PE).