Label-free multimodal nonlinear optical microscopy for the study of therapy induced senescent cells

Optical microscopy has had a profound impact on biology, thanks to its sub-micrometer spatial resolution and the ability to utilize molecule-specific fluorescent bio-markers. These qualities have established it as a standard tool in the field, enabling the investigation of live cells at the sub-cellular level and the exploration of their intricate functions and interactions in dynamic studies. Despite these advantages, traditional fluorescent microscopy methods face challenges in live imaging for biomedicine, including issues such as the need for exogenous molecules to be chemically selective. This impairs the study of samples in their original unperturbed condition, along with dye photobleaching, limited biocompatibility, and time-consuming sample preparation procedures. This thesis demonstrates the potential of multimodal non-linear optical (NLO) microscopy to overcome the drawbacks of traditional techniques. By combining morphological and functional-chemical infor- mation in a label-free modality, multimodal NLO microscopy enriches imaging through multiple complementary contrast mechanisms. The results obtained underscore the power of multimodal NLO microscopy as a non-invasive diagnostic tool for biomedical imaging at the cellular level. The study specifically focuses on characterizing Therapy-Induced Senescence (TIS) across various cell types from different cancers. Chapter 1 delves into the theoretical foundations, explaining the multi-photon processes crucial for NLO in light-matter interactions. Chapter 2 details the multimodal NLO setup used in the thesis, discussing its main components, acquisition modalities, and data processing protocols. Chapter 3 presents the experimental outcomes, beginning with the results obtained through Two-Photon Excited Fluorescence (TPEF), which visualizes endogenous fluorophores essential for cell metabolic activity. Subsequently, Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) measurements, linked to the lipid content of cell bio-matrix, are presented. Despite the challenges associated with lower process cross section with respect to standard linear fluorescence microscopy and the need for higher excitation powers, such as those provided by ultrashort-pulsed laser sources, the label-free nature of NLO imaging outweighs its complexity, placing it as a promising approach for future biomedical diagnostics.

La microscopia ottica ha avuto un profondo impatto sulla biologia, grazie alla sua risoluzione spaziale sub-micrometrica e alla capacità di utilizzare bio-marcatori fluorescenti specifici per le molecole. Queste qualità l’hanno resa uno strumento standard nel campo, consentendo l’indagine di cellule vive a livello subcellulare e l’esplorazione delle loro intricate funzioni e interazioni in studi dinamici. Nonostante questi vantaggi, i metodi tradizionali di microscopia fluorescente devono affrontare delle sfide nell’imaging dal vivo per la biomedicina, tra cui la necessità che le molecole esogene siano chimicamente selettive. Ciò ostacola lo studio dei campioni nelle loro condizioni originali, insieme al fotoscioglimento del colorante, alla limitata biocompatibilità e alle procedure di preparazione dei campioni che richiedono molto tempo. Questa tesi dimostra il potenziale della microscopia ottica non lineare (NLO) multimodale per superare gli inconvenienti delle tecniche tradizionali. Combinando informazioni morfologiche e chimico-funzionali in una modalità priva di etichette, la microscopia NLO multimodale arricchisce l’imaging attraverso molteplici meccanismi di contrasto complementari. I risultati ottenuti sottolineano la potenza della microscopia NLO multimodale come strumento diagnostico non invasivo per l’imaging biomedico a livello cellulare. Lo studio si concentra in particolare sulla caratterizzazione della senescenza indotta dalla terapia (TIS) in vari tipi di cellule di diversi tipi di cancro. Il Capitolo 1 approfondisce le basi teoriche, spiegando i processi multifotonici cruciali per l’NLO nelle interazioni luce-materia. Il Capitolo 2 illustra il setup NLO multimodale utilizzato nella tesi, discutendone i componenti principali, le modalità di acquisizione e i protocolli di elaborazione dei dati. Il Capitolo 3 presenta i risultati sperimentali, iniziando con i risultati ottenuti attraverso la fluorescenza eccitata da due fotoni (TPEF), che visualizza i fluorofori endogeni essenziali per l’attività metabolica delle cellule. Successivamente, vengono presentate le misure di Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS), legate al contenuto lipidico della bio-matrice cellulare. Nonostante le sfide associate alla minore sezione d’urto del processo rispetto alla microscopia a fluorescenza lineare standard e alla necessità di potenze di eccitazione più elevate, come quelle fornite da sorgenti laser a impulsi ultracorti, la natura priva di etichette dell’imaging NLO supera la sua complessità, ponendolo come un approccio promettente per la futura diagnostica biomedica.