Design of a TEER monitoring setup for a Gut-on-Chip model

The oral route for drug administration is the most widely used and non-invasive one. However, the development of orally administered drugs is often hindered by the absorption process which takes place at the intestinal epithelium. To avoid failure of drugs during clinical trials it is fundamental to develop in vitro models able to accurately replicate the physiology of the intestinal epithelium so that the measure of the permeability of drugs across the barrier is significative and reliable. For this reason, innovative in vitro models are being developed, including organoids, 3D scaffolds for cell guidance and Organs-on-Chip (OoCs) devices. Specifically, this Thesis will focus on an OoC device developed by Biomimx® S.r.l., the uStretch® device. Several characterization techniques have been developed to quantitatively and reliably evaluate the ability of in vitro models to replicate the complexity of the intestinal epithelium. These include immunofluorescence staining, permeability assays, and Trans-Epithelial Electrical Resistance measurements. Specifically, TEER is a quantitative measure of the tight junction formation in the barrier: the higher the electrical resistance, the higher the tightness of the barrier. The aim of this Thesis work was thus to design and integrate a TEER setup in the uStretch® device. TEER measurements were performed in two ways: based on the Ohm’s law and as Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS). For these measurements two sets of electrodes were produced and tested: coil electrodes and needle electrodes. Both sets are placed in a fixed position in the chip and have shown reliable results when employed for TEER measurements on solutions with different salts concentrations: from deionized water to 10x Phosphate Buffered Saline (PBS). TEER based on the Ohm’s law is usually performed with commercial devices such as Millicell® ERS-2, that provides a squared wave alternated current with fixed amplitude. The main limitation of this instrument, however, is related to the short range of resistance that can be measured. To overcome this limitation Digilent® Analog Discovery 2 (AD2) was programmed with MATLAB to provide a squared wave current with a feedback-loop iterative process. Concerning biological experiments, chips cultured with cells were compared to blank chips as reference. Resistance/impedance values higher than the blank were recorded due to the presence of a cell construct. However, TEER values were lower compared to the gold standard cultures on Transwell® plates. It was then confirmed by dextran permeation and live and dead staining that it was not formed an effective barrier. Nonetheless, TEER measurements have proven to be reliable thanks to the experimental setup. Anyway, to be able to use AD2 alone to measure TEER based on the Ohm’s law, refinements are still needed concerning the electronics implementation.

La via orale è la più utilizzata e la meno invasiva per la somministrazione di farmaci. Tuttavia, lo sviluppo di questi farmaci è spesso ostacolato dal processo di assorbimento che avviene attraverso l'epitelio intestinale. Per evitare il fallimento dei farmaci durante gli studi clinici è fondamentale sviluppare modelli in vitro in grado di replicare con precisione la fisiologia dell'epitelio intestinale in modo che la misura della permeabilità dei farmaci attraverso la barriera sia significativa e affidabile. Per questo motivo, sono in fase di sviluppo modelli innovativi in vitro, tra cui organoidi, scaffold 3D per la cell guidance e dispositivi Organ-on-Chip (OoC). In particolare, questa tesi si concentrerà su un dispositivo OoC sviluppato da Biomimx® S.r.l., lo uStretch®. Diverse tecniche di caratterizzazione sono state sviluppate per valutare quantitativamente e in modo affidabile la capacità dei modelli in vitro di replicare la complessità dell'epitelio intestinale. Questi includono lo staining in immunofluorescenza, le analisi di permeabilità e le misure di Resistenza Elettrica Trans-Epiteliale (TEER). In particolare, la TEER è una misura quantitativa della formazione di tight junctions nella barriera: maggiore è la resistenza elettrica, maggiore è la tenuta della barriera. L'obiettivo di questo lavoro di Tesi era quindi quello di progettare e integrare un setup per la misura della TEER nel dispositivo uStretch®. Le misure TEER sono state eseguite in due modi: secondo la legge di Ohm e attraverso Spettroscopia di Impedenza Elettrochimica (EIS). Due serie di elettrodi sono state prodotte e testate: elettrodi a bobina ed elettrodi ad ago. Entrambi i set vengono inseriti nei chip in una posizione fissa e hanno mostrato risultati affidabili quando utilizzati per misurare la TEER su soluzioni con diverse concentrazioni di sali: dall'acqua deionizzata a 10 volte la concentrazione di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). La TEER secondo la legge di Ohm viene solitamente misurata con dispositivi commerciali come Millicell® ERS-2, che fornisce corrente alternata con forma di un’onda quadra di ampiezza fissa. Il limite principale di questo strumento, tuttavia, è la massima resistenza che può essere misurata. Per superare questa limitazione Digilent® Analog Discovery 2 (AD2) è stato programmato con MATLAB per fornire un’onda quadra di corrente con un processo iterativo di feedback-loop. Per quanto riguarda gli esperimenti biologici, i chip coltivati con le cellule sono stati confrontati con i chip bianchi di riferimento. Sono stati registrati valori di resistenza/impedenza maggiori del bianco dovuti alla presenza di un costrutto cellulare. Tuttavia, i valori di TEER erano più bassi rispetto alle colture su piastre Transwell®, considerate il gold standard. È stato poi confermato dalla permeazione del destrano e dal saggio live and dead, che non si era formata una barriera efficace. Ciononostante, le misure TEER si sono dimostrate affidabili grazie al setup sperimentale. In ogni caso, per essere in grado di usare AD2 da solo per misurare la TEER secondo la legge di Ohm, sono ancora necessari miglioramenti per quanto riguarda i componenti elettronici.