Design, development, and validation of a 3D-printed bioreactor for automated decellularization of tubular tissue

Degenerative pathologies affecting organ function are primarily treated through transplantation. However, this approach faces significant obstacles, including organ rejection, side effects of anti-rejection therapy, and a shortage of suitable organs. Tissue engineering offers a new therapeutic solution to restore, maintain and improve tissue function. It is a promising option that promotes cell growth to reconstruct tissue, using scaffolds, either synthetic or biological. Synthetic scaffolds are readily available but may lack optimal surface characteristics for cell adherence and signaling cues. Biological scaffolds actively promote cell growth but require meticulous removal of potential immune-triggering elements before use in allogeneic applications. The bioreactor supports the cell-laden scaffold. Since different tissues require varied stimulations, the design involves various parameters for greater efficacy. Through real-time monitoring, the bioreactor enables automated control to create a biomimetic, sterile environment with specific pH value, facilitating solution distribution and waste elimination. In the field of cardiovascular surgery, the golden standard for aortic replacement is predominantly autologous transplant using saphenous vein or mammary artery. Recently, tissue engineering has offered more viable options for aortic regeneration thanks to the improvements in the bioreactor design. One of the most promising techniques is 3D-bioprinting, which can produce custom made vessels by using substrates known as bioinks. They are a formulation of cells supported by biologically active components such as decellularized extracellular matrix (dECM). In the literature, the production of dECM has mainly been carried out manually through either chemical, physical or biological processes of decellularization. Their aim is to remove antigens while preserving the biomechanical properties of the extracellular matrix. Recently, research has been focusing on the automation of this process. The target is to reduce the decellularization time and improve its efficiency, while also standardizing the process and reducing operational errors and costs. This thesis work presents a bioreactor for automated decellularization of the aorta. The process starts with the insertion of the native tissue and ends with the retrieval of the decellularized structure. The key aspects are addressed, such as a user-friendly and versatile design, with minimal interaction from the user during the process. Furthermore, the tissue was stimulated by controlling the detergent flow, improving the protocol efficacy. Finally, the overall cost was lowered by reducing the amount of reagent used in the process. The system has achieved significant results with laboratory-scale validation.

Le patologie degenerative che influenzano la funzionalità degli organi vengono trattate principalmente attraverso il trapianto. Tuttavia, questo approccio ha riscontrato nel tempo diversi ostacoli, tra cui il rigetto, effetti collaterali dati dalle terapie immunosoppressive e la scarsità di organi idonei. L’ingegneria dei tessuti offre una nuova soluzione terapeutica al fine di ripristinare, mantenere e migliorare la funzionalità dei tessuti. Questa opzione favorisce la crescita delle cellule per la ricostruzione dei tessuti grazie all’utilizzo di scaffold, sia sintetici sia biologici. I primi sono facilmente reperibili, ma potrebbero non presentare caratteristiche superficiali ottimali per l’adesione delle cellule e la trasmissione di segnali biologici, mentre gli altri favoriscono attivamente la crescita delle cellule, ma, prima del loro utilizzo, richiedono la rimozione meticolosa degli elementi che potenzialmente potrebbero causare una risposta immunitaria. Il bioreattore è in grado di contenere il costrutto composto da cellule e scaffold. Poiché tessuti diversi richiedono specifiche stimolazioni, vengono considerati diversi parametri nella realizzazione del design per una maggiore efficacia. Attraverso il monitoraggio in tempo reale, inoltre, il bioreattore consente un controllo automatizzato per creare un ambiente biomimetico e sterile con un valore specifico di pH, facilitando la distribuzione della soluzione e l’eliminazione delle sostanze di scarto. Nel campo della chirurgia cardiovascolare, la tecnica più diffusa per la sostituzione dell’aorta è il trapianto autologo di vena safena o arteria mammaria. Recentemente l’ingegneria dei tessuti ha proposto opzioni più valide per la rigenerazione dell’aorta grazie al miglioramento del design di bioreattori. Uno degli approcci più promettenti è il 3D-bioprinting, che può produrre vasi su misura utilizzando il bioink, ovvero una formulazione di cellule supportate da componenti biologici attivi come la matrice extracellulare decellularizzata (dECM). La decellularizzazione mira a rimuovere gli antigeni presenti nel tessuto nativo, preservando le proprietà biomeccaniche della matrice extracellulare. La dECM rappresenta quindi una buona impalcatura per la semina e la coltura cellulare nelle fasi di ricellularizzazione. La sua produzione viene effettuata principalmente manualmente attraverso processi chimici, fisici e biologici. Recentemente, la ricerca si è concentrata sull’automazione di questo processo. L’obiettivo è ridurne la durata, migliorarne l’efficienza, standardizzarlo e ridurre gli errori e i costi operazionali. Questo lavoro di tesi presenta un bioreattore per la decellularizzazione automatica dell’aorta. Il processo inizia con l’inserimento del tessuto nativo e termina con il recupero della struttura decellularizzata. Abbiamo ottenuto un sistema facile da utilizzare, con un design versatile, che permette la minima interazione da parte dell’utente lungo il processo. Durante il suo sviluppo è stata mostrata particolare attenzione alla riduzione dei costi, abbassando ad esempio la quantità di reagente utilizzato. Inoltre, il sistema permette di stimolare il tessuto controllando il flusso del detergente, migliorando l’efficacia del protocollo. Questo setup è stato validato in laboratorio.