Development and analysis of crystal encrustation and biofilm in a new design of Stent-on-Chip

Ureteral stents are essential urological tools used to maintain and/or restore the drainage of urine from the kidney to the bladder. They are placed in the ureter in case of intrinsic obstructions (e.g., kidney stones, strictures), extrinsic obstructions (e.g., tumours, preg- nancy) or prevention (e.g., kidney transplantation). However, these thin catheters suffer from clinical complications, with encrustation and biofilm formation being recognized as the primary cause for stent failure. From all the strategies implemented to reduce these phenomena, the one investigated in this thesis regards topographic changes designed to optimize stents’ performances, focusing on the impact of fluid dynamics. The newly de- veloped and envisioned ureteral stent design, was investigated with microfluidics, using Stent-on-Chips, produced via soft lithography. In particular, this project aims to develop a protocol to study the crystal attachment and biofilm formation in ureteral stents with topography changes. At the same time, the evaluation of the effectiveness of the novel channel geometry in diminishing encrustations was addressed. This Stent-on-Chip consists of a microfluidic channel with equally-spaced grooves, referred to as "cavities", characterized by different heights. Ideally, they should act as trapping sites for crystals and bacteria, diminishing their amount in the stent lumen, thus avoiding blockages. Computational Fluid Dynamics simulations were carried out in order to spatially correlate the predicted shear stress field with the experimentally observed distributions of crystals and bacteria within the microchips. Particle Tracking Velocimetry was also performed, to validate the predicted fluid dynamics. To assess crystal attachment on the newly created surface topography, we simulated a super-saturated, non-infected urine environment by perfusing artificial urine into the Stent-on-Chip. It was observed that the quantity of crystals entering, and likely encrust- ing, inside the cavities was proportional to the cavity size. From the experiments with bacteria, a similar trend emerged, as the majority of the final bacterial aggregation was concentrated in the largest cavity. To understand if the bacteria were developing biofilm, we conducted two staining experiments employing different fluorescent dyes, showing that indeed some mature biofilm was present. When comparing the experimental data of particles behaviour in the microchip with 2D CFD predictions, it became clear that the expected vortex formation within the cavities, leading to particles trapping, was absent in the microfluidic system. The fundamental reason for the inconsistent results lay in a non-optimized aspect ratio of the fabricated SoC. Specifically, it was demonstrated that a microfluidic channel with aspect ratio ≥ 0.4 would significantly enhance the current outcomes, creating fluid dynamic conditions con- ducive to effective particles trapping within the cavities. This knowledge holds valuable implications for various other applications of microfluidics. In conclusion, further analysis of this design or similar ones, should consider employing new aspect ratios to achieve more accurate insights.

Gli stent ureterali sono dispositivi essenziali nella pratica urologica, usati per mantenere o ristabilire il corretto flusso urinario, dal rene alla vescica. Essi sono impiantati negli ureteri in caso di ostruzioni intrinseche (calcoli renali o stenosi), estrinseche (a causa di tumori o gravidanza) o per prevenzione (e.g. trapianto di rene). Purtroppo questi sottili cateteri soffrono di complicazioni cliniche quali, soprattutto, incrostazione e formazione di biofilm batterico, sia in zone intraluminali sia sulla loro superficie esterna, che possono portare al fallimento dello stent. Tra tutte le strategie sviluppate al fine di ridurre questi fenomeni, quella investigata in questa tesi riguarda delle modifiche topografiche volte ad ottimizzare le performance dello stent, focalizzandosi sull’impatto della fluido-dinamica. Questo design di stent ureterale recentemente concepito e sviluppato, è stato analizzato in microfluidica utilizzando Stent-on-Chip realizzati tramite soft-litografia. In particolare, questo progetto mira a sviluppare un protocollo per studiare l’accumulo di cristalli e la formazione di biofilm in stent ureterali che presentano modifiche nella topografia. Contemporaneamente, è stato possibile valutare l’efficacia di questa nuova geometria di stent, nel diminuire le incrostazioni; il canale dello Stent-on-Chip in esame presenta incavi rettangolari equamente spaziati (definiti "cavità"), che differiscono da un chip all’altro nell’altezza. Idealmente, esse dovrebbero fungere da siti di trapping per cristalli e batteri, liberandone, così, il lume e impedendo ostruzioni dello stent. Simulazioni di Computational Fluid Dynamics sono state implementate al fine di correlare spazialmente il campo degli shear stress predetto dal software, con le distribuzioni di cristalli e batteri osservate sperimentalmente all’interno dei SoC. Inoltre, la tecnologia di Particle Tracking Velocimetry è stata utilizzata per validare la fluido dinamica simulata computazionalmente. Per valutare il deposito cristallino su questa nuova topografia superficiale creata, abbiamo simulato un ambiente non infettato di urina artificiale supersatura, infondendo questo specifico fluido nei SoC. E’ stato osservato che la quantità di cristalli che entravano, e molto probabilmente si incrostavano, nelle cavità, era proporzionale alla dimensione della cavità. Gli esperimenti con i batteri hanno mostrato un esito simile, in quanto la maggior parte delle aggregazioni batteriche si trovava nelle cavità più estese. Per capire se i batteri stavano sviluppando biofilm, sono stati condotti due diversi esperimenti di colorazione, che hanno impiegato due coloranti fluorescenti ed hanno suggerito che in effetti era presente del biofilm maturo. Confrontando i dati sperimentali del comportamento delle particelle all’interno del mi- crochip con le predizioni CFD bidimensionali, è risultato chiaro che la formazione di vortici attesa nelle cavità, che avrebbe causato l’intrappolamento delle particelle, era assente nel sistema microfluidico. La ragione fondamentale di questi risultati inconsistenti, risiedeva nel fatto che le proporzioni dimensionali (aspect ratio) dei SoC fabbricati non erano otti- mali. In particolare, è poi stato dimostrato che un canale microfluidico con aspect ratio ≥ 0.4, potenzierebbe notevolmente i risultati attuali, grazie alla generazione di condizioni fluido dinamiche che favoriscono un effettivo intrappolamento di queste particelle nelle cavità. Queste informazioni hanno importanti implicazioni per varie altre applicazioni della microfluidica. In conclusione, le future analisi di questo design o di simili, dovrebbero considerare di impiegare nuovi aspect ratio per ottenere risultati più accurati.