Stretching-based cell stimulation for enhancing non-viral gene delivery in vitro

This Thesis work was aimed at the design, development and validation of an innovative in vitro transfection technique, based on the combination of physical and non-viral vector-based methods, with the purpose to efficiently improve the overall transfection efficiency (i.e., the successful introduction of the transgene in cells and its expression) of gold standard PEI-based polyplexes (PPs). In this context, a brand-new device able to exert uniaxial cyclic stretching to cells cultured onto custom-made poly-dimethyl-siloxane (PDMS) chambers was developed and the strain distribution of culture substrates during stimulations was evaluated both experimentally and in silico through Finite Element Method (FEM) simulations. Finally, transfection assays under dynamic conditions were carried out to determine the optimal stimulation parameters (i.e., stimulation time, frequency, and strain amplitude) to enhance the transfection efficiency of PEI-based PPs. Interestingly, mechanical stimuli applied to cells improved PPs internalization, thus leading to greater transfection outcomes. These findings outlined the relevance of cell responses to exogenous stimuli on the internalization and expression of a gene of interest and established an innovative approach for non-viral delivery ex vivo.

Il presente lavoro di Tesi è focalizzato sulla progettazione, sviluppo e validazione di una tecnologia di trasfezione innovativa in vitro, basata sulla combinazione di metodi fisici e vettori non virali, con l'obiettivo di migliorare efficacemente la complessiva efficienza di trasfezione (ovvero, l'introduzione riuscita del transgene nelle cellule e la sua espressione) di poliplessi (PP) a base di polietilenimmina (PEI) gold standard. In questo contesto, è stato sviluppato un dispositivo innovativo in grado di esercitare uno stiramento ciclico uniassiale a cellule seminate su camere di coltura realizzate su misura in polidimetilsilossano (PDMS), e la distribuzione della deformazione dei substrati di coltura durante la stimolazione è stata valutata sia sperimentalmente sia in silico mediante simulazioni col metodo degli elementi finiti (FEM). Infine, sono stati effettuati saggi di trasfezione in condizioni dinamiche per determinare i parametri di stimolazione ottimali (ovvero, durata, frequenza, e ampiezza della deformazione) per migliorare l'efficienza di trasfezione dei PP a base di PEI. L'applicazione della stimolazione meccanica alle cellule ha comportato un complessivo miglioramento dell'internalizzazione di PP, portando dunque a risultati di trasfezione più elevati. Questi risultati hanno evidenziato l'importanza delle risposte cellulari agli stimoli esogeni in relazione all'internalizzazione e all'espressione di un gene di interesse, stabilendo così un approccio innovativo per la somministrazione ex vivo di vettori non virali.