Progettazione di sistemi di coltura in vitro per l'ingegnerizzazione dell'epitelio intestinale

Over the years, preclinical in vitro models have been developed, contributing to the understanding of some fundamental components of intestinal functions, to study cellular mechanisms in healthy and pathological conditions. The present work aims to create an in vitro model of Caco-2 seeded on Gel-NB and porous Gel-NB substrates, for the engineering of the intestinal epithelium through long-term culture. To support long term cell culture, a custom culture plate equipped with inserts, specially made to minimize sample damage and improve their handling during cell culture, was designed and fabricated. During the research, viability, growth dynamics and cellular differentiation were evaluated. To study the cell differentiation process, the tight junction membrane proteins, claudin and occludin, were chosen as indicators. This investigation was performed using the immunofluorescence technique with antibodies, the protocol of which was optimized during the study. In order to support hypotheses regarding cellular differentiation, a qRT-PCR analysis was performed to evaluate the expression of characteristic brush border enzymes, such as alkaline phosphatase (ALPI) and sucrase-isomaltase (SI). The customized cell culture system proved to be advantageous in the seeding and maintenance phases. Cellular characterization highlighted that Caco-2 remained viable on the substrates examined after four weeks of culture. From the immunofluorescence results it can be seen that the model is able to achieve an enterocytic phenotype at late confluence, expressing the typical proteins of the cytoskeleton as well as tight junctions between adjacent cells. The differentiation is also confirmed by the analysis of the enzymatic expression of ALPI and SI. However, from the data obtained it was not possible to identify a recurring trend of expression between the various types of substrates over the weeks of culture. From an overall evaluation of the tests conducted, it can be concluded that both variants of Gel-NB are configured as suitable substrates for the proliferation and differentiation of the cell line under examination. This thesis contributes to the development of in vitro systems for long-term studies, introducing an improved approach to the management and handling of cellular constructs during cell culture.

Nel corso degli anni, per poter meglio studiare i meccanismi cellulari in condizioni sane o patologiche, sono stati sviluppati modelli preclinici in vitro che hanno contribuito alla comprensione di alcune delle componenti fondamentali delle funzioni intestinali. Il presente lavoro si pone come obiettivo la realizzazione di un modello in vitro di una linea cellulare (Caco-2) seminata su substrati di Gel-NB e Gel-NB poroso, per l’ingegnerizzazione dell’epitelio intestinale attraverso una coltura a lungo termine. Nella fase di studio preliminare è stata progettata e prodotta una piastra di coltura in materiale biocompatibile, dotata di inserti appositamente realizzati per ridurre il rischio di danneggiamento dei substrati e migliorarne la maneggiabilità nel corso della coltura. Durante la fase di ricerca, sono state attentamente monitorate la vitalità, la dinamica di crescita e il differenziamento cellulare. Per studiare il processo di differenziamento cellulare, sono stati scelti come indicatori specifici le proteine di membrana delle giunzioni strette, claudina e occludina. Tale indagine è stata eseguita tramite la tecnica di immunofluorescenza con anticorpi, il cui protocollo è stato ottimizzato durante lo studio. Al fine di supportare le ipotesi riguardanti il differenziamento cellulare, è stata eseguita un'analisi qRT-PCR per misurare l'espressione degli enzimi caratteristici dell'orletto a spazzola, come la fosfatasi alcalina (ALPI) e la saccarosio-isomaltasi (SI). Il sistema di coltura su misura si è rivelato vantaggioso in fase di semina e di mantenimento. La caratterizzazione cellulare ha evidenziato che le Caco-2 si mantengono vitali dopo quattro settimane di coltura sui substrati in esame. Dai risultati dell’immunofluorescenza si evince che il modello è in grado di raggiungere un fenotipo enterocitario alla confluenza tardiva, esprimendo le proteine tipiche del citoscheletro nonché giunzioni strette tra cellule adiacenti. Il differenziamento è confermato inoltre dall’analisi della trascrizione di alcuni enzimi specifici come la Fosfatasi Alcalina (ALPI) e la Saccarosio-Isomaltasi (SI). Nonostante dai dati ottenuti non siano stati evidenziati cambiamenti significativi dell’espressione di questi geni, osservando nel complesso i risultati si può concludere che entrambe le varianti di Gel-NB si configurano come substrati idonei per la proliferazione e il differenziamento della linea cellulare in esame. Il presente elaborato di tesi contribuisce allo sviluppo di sistemi in vitro per studi a lungo termine, introducendo un approccio migliorato alla gestione e maneggevolezza dei costrutti cellulari durante la coltura.