Design and Optimization of Transfection (DeOT) process in HeLa cells using PEI/pDNA polyplexes

Non-viral gene delivery approaches are gaining prominence as safer alternatives to viral vectors in gene therapy, despite their relatively lower efficiency. Despite extensive attention has been dedicated to advancing the development of non-viral vectors so far, experimental evidence reports conflicting results on performances and a substantial discrepancy among laboratory protocols. In this context, the goal of this Thesis was to shed light on this performance discrepancy, using gold standard PEI/DNA complexes as the key study, and obtain a standard protocol for an optimized transfection process. Drawing from the principles of Design of Experiments (DoE), we crafted an operational sequence tailored to specific transfection modeling and optimization and pinpointing the most effective transfection conditions. To ensure its applicability, a Full Factorial Design (FFD) was initially performed, followed by a Response Surface Methodology (RSM) for further analysis. A previous comparative analysis of the performance between the VibroFect device and mixing complexation methods has enabled the narrowing down of the factors to be included in the experimental design to 4. The transition to RSM aimed to optimize the transfection process and to build a predictive model that can potentially extend its application to other vectors, nucleic acids, and cell lines, maximizing the transfection efficiency while minimizing cytotoxicity. To summarize, the utilization of such Design and Optimization of Transfection process (DeOT) in this thesis enabled us to minimize the range of experimental conditions while maximizing the acquired information.

Gli approcci non virali per la consegna genica stanno guadagnando importanza come alternative più sicure rispetto ai vettori virali nella terapia genica, nonostante la loro efficienza relativamente inferiore. Malgrado finora sia stata dedicata ampia attenzione allo sviluppo di vettori non virali, le evidenze sperimentali riportano risultati contrastanti sulle loro prestazioni e una notevole discrepanza tra i protocolli di laboratorio. In questo contesto, l'obiettivo di questa Tesi è quello di fare chiarezza su questa incongruenza nelle prestazioni, utilizzando i complessi PEI/DNA, ritenuti il gold standard, come oggetto di studio per ottenere un protocollo standard di trasfezione ottimizzato. Sfruttando i principi del Design of Experiments (DoE), abbiamo elaborato una sequenza operativa su misura per la modellizzazione e l'ottimizzazione del processo di trasfezione, andando ad individuare le condizioni che permettono di ottenere un’efficienza più elevata. Per garantire l'applicabilità di questa metodica, è stato inizialmente eseguito un Full Factorial Design (FFD), seguito da una Response Surface Methodology (RSM). È stata effettuata un’analisi comparativa preliminare tra le prestazioni di VibroFect device e i metodi di complessazione tradizionali, che ha permesso di restringere i fattori da includere nel design sperimentale a 4. L’utilizzo di una RSM ha lo scopo di ottimizzare il processo di trasfezione e costruire un modello predittivo in grado di estendere potenzialmente la sua applicazione ad altri vettori, acidi nucleici e linee cellulari, massimizzando l'efficienza di trasfezione e minimizzando la citotossicità. In sintesi, l'utilizzo di un tale Design and Optimization of Transfection (DeOT) process in questo lavoro ha consentito di ridurre al minimo il range delle condizioni sperimentali massimizzando le informazioni acquisite.