Ultrasound-responsive ozone-loaded nanodroplets for the treatment of bacterial biofilms in chronic wounds

Ozone-loaded liquid-perfluorocarbon nanodroplets (NDs) present a promising alternative to microbubbles (MBs) and traditional antibiotics for ultrasound-based therapeutic applications showcasing potent antibacterial efficacy. The size and distribution of NDs significantly impact their performance in vivo, affecting factors such as ozone encapsulation and responsiveness to ultrasound stimulation. Consequently, there is a need to explore methods for customizing ND size and distribution during the manufacturing process. Nanodroplets were synthesized by manufacturing a lipid film using 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) and polyoxyethylene(40)stearate (PEG40s) in molar ratio 9:1, which stabilized a perfluoro-n-pentane (PFP) core shell. They were produced in phosphate-buffered saline (PBS) by sonication. The effect of temperature variation on NDs size and concentration distribution is investigated: temperature variations (35°C, 20°C, and 4°C) impact nanodroplet stability, with 20°C showing optimal conditions for uniform concentration and size distribution. Ozone loading was quantified using the INDIGO colorimetric method. Results from the ozone loading phase reveal varying absorbance values at different dilutions (1:12.5, 1:25, and 1:50), emphasizing the importance of formulation in achieving stable ozone encapsulation. The 1:25 dilution stands out as the most promising, maintaining optimal absorbance and concentration levels in both loaded and unloaded states. Direct correlation between nanodroplet concentration and absorbance confirmed the potential for higher therapeutic doses with less diluted solutions. Size analysis indicated that ozone loading minimally affects nanodroplet dimensions but significantly influences actual concentration. Ozone encapsulation within nanodroplets displayed instability over time, highlighting a complex release kinetics influenced by various factors. Increased concentration of perfluoropentane positively impacted stability, suggesting potential for sustained ozone release. Moreover, the ultrasound-induced cavitation experiments demonstrate nanodroplet response across different frequency bands. The Power Spectral Density Spectrogram indicates consistent activity around the 0.5 MHz driving frequency, while the Averaged Power Sum graph highlights the effectiveness of the broadband frequency group for cavitation and average power values, with the broadband group exhibiting the highest effectiveness (75.1 dB). These findings provide valuable insights for optimizing therapeutic protocols, enhancing contrast in diagnostic imaging, and improving drug delivery through targeted release

Le nanodroplet di perfluorocarburi caricati di ozono (ND) costituiscono una promettente alternativa a microbolle (MB) e antibiotici tradizionali per applicazioni terapeutiche basate su ultrasuoni, dimostrando una potente efficacia antibatterica. La dimensione e la distribuzione dei ND influenzano significativamente le loro prestazioni in vivo, coinvolgendo fattori come l'incapsulamento dell'ozono e la risposta alla stimolazione ad ultrasuoni. Di conseguenza, è necessario esplorare metodi per personalizzare dimensioni e distribuzione dei ND durante il processo di produzione. Le nanodroplet sono stati sintetizzati mediante la creazione di un film lipidico con 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-colina (DPPC) e poliossietilene (40)stearato (PEG40s) in rapporto molare 9:1, stabilizzando un nucleo di perfluoro-n-pentano (PFP). Sono stati prodotti in soluzione tampone fosfato (PBS) tramite sonificazione. L'effetto delle variazioni di temperatura (35°C, 20°C e 4°C) sulla dimensione e la distribuzione dei ND è stato investigato, con la temperatura di 20°C che mostra condizioni ottimali per uniformità di concentrazione e dimensioni. Il caricamento di ozono è stato quantificato utilizzando il metodo colorimetrico all'indaco. I risultati della fase di caricamento dell'ozono mostrano valori di assorbanza variabili a diverse diluizioni (1:12,5, 1:25 e 1:50), sottolineando l'importanza della formulazione nel raggiungere un'incapsulazione stabile dell'ozono. La diluizione 1:25 si distingue come la più promettente, mantenendo livelli ottimali di assorbanza e concentrazione sia nello stato caricato che scarico. La correlazione diretta tra concentrazione di nanodroplet e assorbanza conferma il potenziale per dosi terapeutiche più elevate con soluzioni meno diluite. L'analisi delle dimensioni indica che il caricamento dell'ozono influenza minimamente le dimensioni delle nanodroplet ma influenza significativamente la concentrazione effettiva. L'incapsulazione dell'ozono all'interno delle nanodroplet mostra instabilità nel tempo, evidenziando una cinematica di rilascio complessa influenzata da vari fattori. Un aumento della concentrazione di perfluoropentano influisce positivamente sulla stabilità, suggerendo un potenziale rilascio sostenuto dell'ozono. Inoltre, gli esperimenti di cavità indotti da ultrasuoni dimostrano la risposta delle nanodroplet attraverso diverse bande di frequenza. Lo spettrogramma della densità spettrale di potenza indica un'attività coerente intorno alla frequenza di guida di 0,5 MHz, mentre il grafico della somma di potenza media evidenzia l'efficacia del gruppo di frequenza a banda larga per la cavità e i valori di potenza media, con il gruppo a banda larga che mostra la massima efficacia (75,1 dB). Questi risultati forniscono preziose informazioni per ottimizzare protocolli terapeutici, migliorare il contrasto nell'immagine diagnostica e migliorare la somministrazione di farmaci attraverso il rilascio mirato.