High-speed label-free 3D biomedical imaging through multiphoton and broadband CARS microscopy

Label-free vibrational imaging techniques play a crucial role in generating detailed chem- ical maps of cells and tissues, with Spontaneous Raman (SR) standing as the benchmark method due to its chemical specificity. However, it suffers from a low scattering cross- section that hampers imaging speed, hence the need for Coherent Raman Scattering tech- niques (CRS) like Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS). CARS overcome the limitations of SR by exploiting the third-order non-linear optical response of the sample. Narrowband CARS is its simplest implementation it employs a pair of narrowband pulses to probe a single vibrational mode at a time. A vibrational mode is coherently excited when the frequency difference between the two beams matches the mode resonance fre- quency. A second interaction with the pump then probes the vibrational mode generating a stronger anti-Stokes signal compared to SR. However, this configuration reveals only one vibrational mode at a time instead of multiple modes as SR does. Broadband CARS (BCARS) addresses this limitation by combining the acquisition speed of single-frequency CARS with the chemical specificity of SR. Indeed it combines narrowband pump pulses with broadband Stokes pulses that allow the excitation and probing of broader vibrational spectrum. This thesis presents and improves an innovative BCARS setup converting it into a versatile multimodal microscope and proving its capabilities. Chapter 1 introduces the theory behind the CARS and B-CARS processes. Chapter 2 meticulously describes the BCARS setup, discussing its evolution into a multimodal microscope. Chapter 3 focuses on the acquisition and post-processing pipeline for CARS spectroscopy and imaging. Chapter 4 presents the experimental outcomes, including the analysis of standardized samples, 3D sectioning of spheroids, imaging of tumoral breast tissue and resonant response of crystals. It also discusses the use of second harmonic generation (SHG) and three-photon excited fluorescence (3PEF) in conjunction with CARS. These experiments highlight the incredible potential of BCARS microspectroscopy as a standalone technique and even more in a multimodal microscope.

Le tecniche di imaging vibrazionale label-free sono cruciali per la generazione di mappe chimiche di cellule e tessuti e il Raman Sponaneo (SR) si pone come metodo di riferimento grazie alla sua specificità chimica. Tuttavia la ridotta sezione d’urto di scattering ne limita la velocità di imaging, da qui la necessità di tecniche di Scattering Raman Coerente (CRS) come il Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS). Il CARS supera le limitazioni del SR sfruttando la risposta ottica non lineare di terzo ordine del campione. Il CARS narrowband è la più semplice implementazione di questa tecnica, sfrutta una coppia di impulsi narrowband per misurare un singolo modo vibrazionale. Un modo vibrazionale viene eccitato coerentemente quando la differenza di frequenza tra i due fasci combacia con la frequenza vibrazinale del modo. Successivamente una seconda interazione con la pompa sonda il modo vibrazionale generando un segnale anti-Stokes più forte rispetto al SR. Tuttavia, questa configurazione rivela solo un modo vibrazinale alla volta. Broadband CARS (BCARS) affronta questa limitazione combinando la velocità di acqui- sizione del CARS a singola frequenza con la specificità chimica del SR. Infatti combina impulsi di pompa a banda stretta con impulsi Stokes a banda larga che consentono di eccitare e misurare uno spettro vibrazionale più ampio. Questa tesi presenta e migliora un setup BCARS trasformandolo in un versatile micro- scopio multimodale. Il Capitolo 1 introduce la teoria relativa a CARS e B-CARS. Il Capitolo 2 descrive il setup e la sua evoluzione. Il Capitolo 3 si concentra sulla processo di acquisizione e elaborazione dati. Il Capitolo 4 presenta i risultati sperimentali, tra cui l’analisi dei campioni standardizzati, is sezionamento in 3D di sferoidi, l’imaging di tessuto tumorale mammario e la risposta risonante nei cristalli. Discute anche l’uso della generazione di secondo armonica (SHG) e della fluorescenza a tre fotoni (3PEF) in con- comitanza con il CARS utilizzando il canale di acquisizione aggiunto. Questi esperimenti mostrano potenziale della microscopia BCARS come tecnica assestante e ancor di più insieme a altri strumenti in un microsopio multimodale.