Caratterizzazione di uno scaffold in fibroina della seta e realizzazione di un bioreattore a perfusione per l'ingegnerizzazione del tessuto tendineo

Tendons, which allow the transmission of muscle strength to the bones, play a crucial role in locomotion, joint stability, and shock absorption. However, they are prone to injuries which heal slowly and ineffectively. Tissue engineering is a promising solution for a more effective regeneration of tendon tissue. The thesis work focuses on the characterization of a silk fibroin scaffold with a structure designed to emulate the hierarchical organization of tendons, which are characterized by fibrils, fibres and fascicles. The analysis of the scaffold has focused not only on the morphological and mechanical aspects, but also on the evaluation of its sterilizability. The morphological characterization, by means of an optical microscope, has shown that the dimensions of each filament, which mimics the function of the fascicles, do not replicate the order of magnitude of fascicles in tendons (1.45 ± 0.05 mm vs 300-500 μm). However, despite such difference, the macroscopic dimensions of the silk fibroin scaffold are adequate to represent the tendon structure (scaffold width 7 ± 0.16 mm, scaffold thickness 2.2 ± 0.41 mm). Additional morphological analyses have shown that the silk fibroin scaffold presents a distance between the strands (0.76 ± 0.12 mm) and, therefore, heterogeneous porosity which is greater than the optimal one that literature suggests using to enhance cell adhesion (200-250 μm) and cell colonization (100-300 μm). Tensile tests carried out during the mechanical characterization have shown that the silk fibroin scaffold has a stress-strain curve like tendons in physiological conditions. However, scaffold’s strain at failure is greater than that of tendons (10-40% as compared to 6-8%). Furthermore, the silk fibroin scaffold shows an ultimate tensile strength value equal to 36 ± 18 MPa and a value of the Young’s modulus equal to 166 ± 6 MPa, which is in the range of physiological values for the regeneration of tendons in the lower limbs (60-1000 MPa). The choice of sterilizing the scaffold with 25 KGy gamma irradiation has proved to be valid and suitable to ensure the effectiveness of the sterilization process, without damaging neither the structural and functional features nor the mechanical properties of the silk fibroin scaffold. In the second phase of the thesis work, a perfusion bioreactor has been made and validated for the dynamic culture of the silk fibroin scaffold for tendon tissue engineering. The bioreactor is adequate for dynamic culture on the scaffold as well as to exert, on the scaffold itself, the right mechanical stress for cell differentiation towards the tenocyte lineage. Validation tests have shown its conformity to design specifications as well as its functionality and reliability as regards the electronic control software, the implementation system, and its hydraulic seal. Furthermore, it has been proved that the bioreactor can maintain sterility during cell culture.

I tendini, fondamentali nel trasferire le forze dai muscoli alle ossa, rivestono un ruolo cruciale nella locomozione, nella stabilizzazione articolare e nell'attenuazione degli urti. Tuttavia, sono suscettibili a lesioni frequenti caratterizzate da processi di guarigione intrinsecamente lenti ed inefficaci. L'ingegneria dei tessuti rappresenta una soluzione promettente per incentivare una rigenerazione più efficace del tessuto tendineo. Il presente lavoro di tesi ha focalizzato l'attenzione sulla caratterizzazione di uno scaffold precedentemente realizzato in fibroina della seta (SF), progettato con una struttura che emula l'organizzazione gerarchica dei tendini, caratterizzati da fibrille, fibre e fascicoli. L'analisi del dispositivo si è concentrata sugli aspetti morfologici e meccanici e sulla valutazione della sua sterilizzabilità. La caratterizzazione morfologica, condotta attraverso il microscopio ottico, ha evidenziato che le dimensioni del singolo filamento, che mima la funzione dei fascicoli tendinei, non replicano l'ordine di grandezza dei fascicoli nei tendini (1.45 ± 0.05 mm rispetto a 300-500 μm). Tuttavia, lo scaffold in SF presenta dimensioni macroscopiche adeguate a rappresentare la struttura tendinea (larghezza dello scaffold 7 ± 0.16 mm, spessore dello scaffold 2.2 ± 0.41 mm). Ulteriori analisi morfologiche hanno rivelato che lo scaffold presenta una distanza tra le maglie (0.76 ± 0.12 mm) e, di conseguenza, una porosità, che è disomogenea e superiore a quella ottimale suggerita dalla letteratura per favorire l'adesione cellulare (200-250 μm) e la colonizzazione cellulare (100-300 μm). Le prove meccaniche a trazione hanno dimostrato che lo scaffold segue una curva sforzo-deformazione simile a quella dei tendini in condizioni fisiologiche. Tuttavia, la deformazione a rottura dello scaffold è risultata maggiore rispetto a quella dei tendini (10-40% rispetto a 6-8%). Inoltre, lo scaffold in SF presenta un valore di sforzo al picco pari a 36 ± 18 MPa e un valore di modulo di Young pari a 166 ± 6 MPa, inserendosi nell'intervallo di valori fisiologici per la rigenerazione dei tendini degli arti inferiori (60-1000 MPa). La scelta della sterilizzazione con radiazioni gamma con intensità di 25 KGy si è rivelata essere valida e sicura a garantire l’efficacia della sterilizzazione senza andare a compromettere le caratteristiche strutturali, funzionali e le proprietà meccaniche dello scaffold. Nella seconda fase di questo lavoro di tesi è stato realizzato e validato un bioreattore a perfusione per la coltura dinamica dello scaffold in SF. Il bioreattore risulta adeguato ad effettuare una coltura dinamica sullo scaffold e ad impartire, su di esso, la corretta sollecitazione meccanica per il differenziamento cellulare verso la linea tenocitica. Le prove di validazione hanno dimostrato la sua conformità alle specifiche di progettazione oltre che la sua piena funzionalità e affidabilità a livello del software di controllo elettronico, del sistema di attuazione e di tenuta idraulica. Inoltre, è stato dimostrato che il bioreattore è in grado di mantenere la sterilità durante la coltura cellulare.