Replicating the microenvironment of intestinal barrier in vitro: a study on substrates and oxygen gradient integration

The aim of this thesis is to develop an in-vitro model of intestinal epithelium in static conditions in a bicompartmental culture system (TToP), designed at µBSLab and Attic Lab of Politecnico di Milano. Particular attention is focused on tuning the microenvironment to mimic physiological conditions. The first step consisted in identifying a suitable substrate to reproduce the mechanical, biological and topographical characteristics of intestinal extra-cellular matrix. At this scope, a comparative experiment was carried out, in order to compare cell growth and differentiation on different substrates through different tools: TEER measurements to assess tightness of the cellular layer, optical microscopy and fluorescence microscopy to analyse morphology and viability. From the comparison among different coating or 3D matrices containing ECM components, substrate’s architecture has emerged as a crucial cue in favouring physiological cells differentiation. Different spatial organization of the cellular population was observed on substrates with different architecture or protein concentration. In particular, spheroidal structures formed on high concentration Matrigel, showed a complex tridimensional organization, with a good potential for a more accurate in vitro modelling. The second goals was to reproduce the oxygen gradient typical of intestinal epithelium, through the design and development of a device that allows to recreate physiological hypoxic conditions in the apical compartment of the cellular monolayer. To validate the geometry and evaluate parameters of interest, such as the gradient formation time interval, COMSOL simulations were performed. The device was then designed and manufactured based on the optimized parameters and geometry and technical tests were conducted to assess its functionality. The biological experimental campaign consisted in characterization of cell culture in the device on a suitable substrate, identified with the previous comparative analysis. Microscopy imaging, immunofluorescence staining and TEER measurements provided experimental readouts related to cell growth and maturation, while a Needle-Type Oxygen microsensor was employed to characterize oxygen gradient.

Il fine che questa tesi si propone è lo sviluppo di un modello in vitro di epitelio intestinale in condizioni statiche, in un sistema di coltura bicompartimentale (TToP), progettato presso il µBSLab e l’Attic Lab del Politecnico di Milano. Particolare attenzione viene riservata alla riproduzione di un microambiente che mimi affidabilmente le condizioni fisiologiche. Il primo obiettivo è consistito nell'individuare un substrato di coltura adeguato a riprodurre le caratteristiche meccaniche, biologiche e strutturali della matrice extracellulare intestinale. Per conseguirlo, è stato eseguito un esperimento comparativo, al fine di confrontare la crescita e il differenziamento cellulare su differenti substrati di coltura attraverso l’utilizzo di diversi strumenti: misurazioni TEER per valutare la selettività del tessuto barriera, microscopia ottica e microscopia a fluorescenza per analizzare morfologia e vitalità cellulare. Dal confronto tra diversi coating o matrici 3D contenenti componenti dell’ECM, la conformazione strutturale del substrato è emersa come un fattore cruciale nel favorire un differenziamento cellulare fisiologico. E’ stato possibile osservare una differente organizzazione spaziale della popolazione cellulare su substrati con diversa struttura o concentrazione proteica. In particolare, le strutture sferoidali formatesi su Matrigel ad alta concentrazione, hanno mostrato un'organizzazione tridimensionale complessa, con un buon potenziale per una più accurata riproduzione in vitro delle condizioni fisiologiche. Il secondo obiettivo era relativo alla riproduzione del gradiente di ossigeno tipico dell'epitelio intestinale, attraverso la progettazione e lo sviluppo di un dispositivo che consentisse di ricreare condizioni ipossiche nel compartimento apicale del monostrato cellulare. Per validare la geometria e valutare i parametri di interesse, come l'intervallo di tempo di formazione del gradiente, sono state eseguite simulazioni COMSOL. Il dispositivo è stato quindi progettato e prototipato sulla base di parametri e geometria ottimizzati. Sono quindi stati condotti test tecnici per valutare la funzionalità del dispositivo. La campagna sperimentale biologica è consistita nella caratterizzazione di colture cellulari nel dispositivo progettato, su un substrato idoneo, individuato con la precedente analisi comparativa. L'imaging al microscopio, la colorazione con immunofluorescenza e le misurazioni TEER hanno fornito letture sperimentali relative alla proliferazione e alla maturazione cellulare, mentre un microsensore ad ago è stato impiegato per caratterizzare il gradiente di ossigeno.