Microfluidic and additive manufacturing technologies for the development of platforms for osteoarthritis modeling and drug screening

Osteoarthritis (OA) is a widespread and debilitating joint disease, imposing significant socioeconomic burdens globally. While OA was traditionally regarded as a degenerative condition primarily driven by mechanical wear on joint cartilage, emerging evidence of subchondral bone changes and synovial membrane inflammation has led to a broader understanding of OA as a multifaceted inflammatory disease affecting all elements of the articular joint. However, unfortunately, current treatments remain predominantly symptomatic, highlighting the pressing need for therapies capable of halting disease progression. This thesis centers on the use of biofabrication techniques, including microfluidics and additive manufacturing, to establish in vitro models of OA. These models have the potential to serve as platforms for investigating disease mechanisms and screening potential drug candidates. Chapter 3, the core of the thesis, introduces a microfluidic model of the osteochondral interface, which replicates the interplay between cartilage and bone, a crucial aspect of OA pathogenesis. This chapter begins with the optimization of culture conditions and model characterization, followed by the development of an OA-like model through the administration of Interleukin-1β (IL1β), a key pro-inflammatory cytokine in OA. The model potential as a drug screening tool is then evaluated by testing the effectiveness of IL1 receptor antagonist (IL1Ra) and Celecoxib, a commonly prescribed anti-inflammatory drug for OA. The response to inflammation and drug treatments is assessed by examining the regulation of genes/proteins related to OA, including inflammation markers, matrix degradation markers, factors related to bone remodeling, and angiogenesis. The model demonstrates promise in predicting the efficacy of drugs, offering a platform that integrates the intricate interactions between cartilage and bone tissues. In addition to subchondral bone, the synovial membrane plays a pivotal role in OA. Indeed, synovial inflammation is a hallmark of the disease, leading to immune cell infiltration, macrophage activation, and ECM degradation. Therefore, targeting synovitis by reducing immune cell infiltration presents a promising approach to control OA progression. Chapter 4 presents a joint microfluidic model encompassing the synovial membrane, joint cavity, and cartilage, enabling the study of monocyte extravasation and potential drug interventions. This chapter builds upon a prior project conducted during my master thesis, extending the study by utilizing the developed model as a drug screening platform for targeting monocytes. Antagonists are applied to monocytes, and their extravasation towards OA synovial fluid is quantified to assess treatment efficacy. In the diverse landscape of managing OA, mesenchymal stem cells (MSCs) therapy has also emerged as an innovative strategy to address the underlying tissue damage and inflammation associated with the condition. However, the response to MSC-based therapies varies among patients, presenting a significant challenge for treatment predictability. Chapter 5 introduces a microfluidic joint model encompassing cartilage and synovium compartments within the joint cavity, tailored for testing biological therapies in a patient-specific manner. The model enables the incorporation of matched chondrocytes, synovial fibroblasts, and synovial fluid from the same donors to create a patient-specific OA environment. Allogenic bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) or adipose-derived stem cells (ASCs) are introduced into the synovial fluid channel, simulating an injective intra-articular therapy. The analysis of cytokine levels in the culture medium and the evaluation of protein expression through fluorescence imaging reveal distinct responses among different donors to these treatments. This microfluidic model holds significant promise as a preclinical platform capable of categorizing OA patients into potential responders and non-responders, paving the way for the development of more personalized and effective OA treatments. While the first three chapters focus on hydrogel-based microfluidic models, which excel in simulating cellular complexity and high biocompatibility, they often fall short in replicating native tissue mechanical properties and the interface between tissues with great mechanical properties mismatch such as osteochondral interface. In this regard, Chapter 6 explores the potential of multi-jet 3D printing to create scaffolds with gradual mechanical properties. Initial plans aimed to create a scaffold transitioning from hard to soft regions, more closely resembling the mechanical properties of cartilage and bone and simulating the missing calcified cartilage zone in the model presented in Chapter 3. However, challenges, such as unexpected material cytotoxicity, led to a shift in focus towards material characterization and cell seeding optimization. Nevertheless, preliminary results reveal differences in cellular behavior based on scaffold mechanical properties, highlighting the importance of cell extracellular matrix properties and their effect on mechanotransduction of cells. In summary, this thesis emphasizes the importance of creating in vitro models that faithfully replicate the complexity of tissues involved in OA to advance our understanding of the disease and treatment strategies. It also advocates the integration of various biofabrication techniques, such as microfluidics, 3D printing, and tissue engineering, to develop hybrid models that more comprehensively represent the intricate interplay of factors within the human joint, offering new avenues for OA research and therapy development.

L’osteoartrite (OA) è una malattia articolare diffusa e debilitante, che impone oneri socioeconomici significativi a livello globale. Mentre l’OA era tradizionalmente considerata una condizione degenerativa determinata principalmente dall’usura meccanica della cartilagine articolare, le prove emergenti di alterazioni dell’osso subcondrale e di infiammazione della membrana sinoviale hanno portato a una più ampia comprensione dell’OA come una malattia infiammatoria multiforme che colpisce tutti gli elementi dell’articolazione articolare. Tuttavia, sfortunatamente, i trattamenti attuali rimangono prevalentemente sintomatici, evidenziando l’urgente necessità di terapie in grado di arrestare la progressione della malattia. Questa tesi è incentrata sull'uso di tecniche di biofabbricazione, tra cui la microfluidica e la produzione additiva, per stabilire modelli in vitro di OA. Questi modelli fungono da piattaforme di studio dei meccanismi della malattia e di selezione di potenziali farmaci candidati. Il capitolo 3, il cuore della tesi, introduce un modello microfluidico dell'interfaccia osteocondrale, che replica l'interazione tra cartilagine e osso, un aspetto cruciale nella patogenesi dell'OA. Questo capitolo è il fulcro dei miei studi di dottorato e riguarda l'ottimizzazione delle condizioni di coltura, la caratterizzazione e lo sviluppo di un modello di OA attraverso la somministrazione di interleuchina-1β (IL1β), una citochina proinfiammatoria chiave nell'OA. Il potenziale del modello come strumento di screening farmacologico viene quindi valutato testando l'efficacia dell'antagonista del recettore IL1 (IL1Ra) e del Celecoxib, un farmaco antinfiammatorio comunemente prescritto per l'OA. La risposta all'infiammazione e ai trattamenti farmacologici viene valutata esaminando la regolazione di geni/proteine correlate all'OA, inclusi marcatori di infiammazione, marcatori di degradazione della matrice, fattori correlati al rimodellamento osseo e angiogenesi. Il modello si dimostra promettente nel prevedere l’efficacia dei farmaci, offrendo una piattaforma che integra le complesse interazioni tra cartilagine e tessuti ossei. Oltre all’osso subcondrale, la membrana sinoviale svolge un ruolo fondamentale nell’OA. Infatti, l’infiammazione sinoviale è un segno distintivo della malattia, che porta all’infiltrazione di cellule immunitarie, all’attivazione dei macrofagi e alla degradazione dell’ECM. Pertanto, prendere di mira la sinovite riducendo l’infiltrazione delle cellule immunitarie rappresenta un approccio promettente per controllare la progressione dell’OA. Il capitolo 4 presenta un modello microfluidico articolare che comprende la membrana sinoviale, la cavità articolare e la cartilagine, estendendo lo studio della extravasazione di monociti e di potenziali interventi farmacologici. Questo capitolo si basa su un progetto condotto durante la mia tesi magistrale e estende lo studio attraverso l’utilizzo del modello sviluppato come piattaforma di screening farmacologico per colpire i monociti. Gli antagonisti vengono somministrati ai monociti e la loro extravasazione verso il liquido sinoviale dell'OA viene quantificato per valutare l'efficacia del trattamento. Nel variegato panorama dei trattamenti dell’OA, la terapia con cellule staminali mesenchimali (MSC) è emersa come strategia innovativa per affrontare il danno tissutale sottostante e l’infiammazione associati alla condizione. Tuttavia, la risposta alle terapie basate sulle MSC varia da paziente a paziente, il che rappresenta una sfida significativa per l’efficacia del trattamento. Il capitolo 5 introduce un modello articolare microfluidico che comprende compartimenti cartilaginei e sinoviali all'interno della cavità articolare, su misura per testare terapie biologiche in modo paziente-specifico. Il modello prevede l'incorporazione di condrociti, fibroblasti sinoviali e liquido sinoviale provenienti dagli stessi donatori per creare un ambiente OA specifico per il paziente. Le cellule staminali mesenchimali allogeniche derivate dal midollo osseo (BMSC) o le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC) vengono introdotte nel canale del liquido sinoviale, simulando una terapia intra-articolare iniettiva. L'analisi dei livelli di citochine nel terreno di coltura e la valutazione dell'espressione proteica attraverso l'imaging a fluorescenza rivelano risposte distinte tra i diversi donatori a questi trattamenti. Questo modello microfluidico è molto promettente come piattaforma preclinica in grado di classificare i pazienti con OA in potenziali rispondenti e non-respondenti, aprendo la strada allo sviluppo di trattamenti per OA più personalizzati ed efficaci. Questo progetto è stato condotto in collaborazione con i Laboratori di ricerca traslazionale dell'Ente Ospedaliero Cantonale in Svizzera. Nello specifico, i miei contributi ruotavano attorno all’utilizzo del modello stabilito per studiare gli effetti antinfiammatori delle cellule staminali. Ho condotto un'analisi su come il modello possa essere efficacemente utilizzato per la stratificazione dei pazienti e ne ho valutato l'efficacia come piattaforma di screening per i trattamenti biologici. Sebbene i primi tre capitoli si concentrino sui modelli microfluidici basati su idrogeli, che eccellono nella simulazione della complessità cellulare e dell'elevata biocompatibilità, questi ultimi spesso non riescono a replicare le proprietà meccaniche dei tessuti nativi e l'interfaccia tra tessuti con grandi proprietà meccaniche non corrispondenti, come l'interfaccia osteocondrale. A questo proposito, il capitolo 6 esplora il potenziale della stampa 3D multi-jet per creare scaffold con proprietà meccaniche graduali. L’interesse iniziale mirava a creare un'impalcatura di transizione dalle regioni dure a quelle morbide, che rappresentasse in dettaglio le proprietà meccaniche della cartilagine e dell'osso e simulasse la zona cartilaginea calcificata mancante nel modello presentato nel capitolo 3. Tuttavia, le sfide, come la citotossicità inaspettata del materiale, hanno portato a uno spostamento dell'attenzione verso la caratterizzazione dei materiali e l'ottimizzazione della semina cellulare. Tuttavia, i risultati preliminari rivelano differenze nel comportamento cellulare in risposta alle proprietà meccaniche dello scaffold, evidenziando l'importanza delle proprietà della matrice extracellulare e il suo effetto sulla meccanotrasduzione nelle cellule. I risultati presentati in questo capitolo derivano dal mio visiting period alla TU Delft, Paesi Bassi, durante il quale ho progettato e condotto personalmente tutti gli esperimenti, le analisi e la stesura di questa sezione. In sintesi, questa tesi sottolinea l’importanza di creare modelli in vitro che replichino fedelmente la complessità dei tessuti coinvolti nell’OA per far avanzare la nostra comprensione della malattia e delle strategie di trattamento. Sostiene inoltre l’integrazione di varie tecniche di biofabbricazione, come la microfluidica, la stampa 3D e l’ingegneria dei tessuti, per sviluppare modelli ibridi che rappresentino in modo più completo l’intricata interazione di fattori all’interno dell’articolazione umana, offrendo nuove strade per la ricerca sull’OA e lo sviluppo terapeutico.