Biofabrication of a 3D in vitro model of human skeletal muscle for fibrosis modeling and drug development

Skeletal muscle fibrosis is a pathological condition associated with various muscle diseases such as dystrophies, laminopathies, injuries, and aging. Its most prominent outcome is the excessive accumulation of extracellular matrix within muscles, ultimately leading to functional failure. Due to the concurrence with the main pathology and the involvement of numerous biochemical and biophysical factors, muscle fibrosis poses a significant challenge in musculoskeletal research. Moreover, the absence of specific therapeutic options emphasizes the urgent need for a better understanding of the pathological mechanisms. Recognizing the great advantages offered by three-dimensional in vitro modeling, the development of more reliable and comprehensive in vitro skeletal muscle models could provide new insights into this pathology. This thesis focuses on the development of an advanced three-dimensional in vitro model of human skeletal muscle. In this work, biofabrication techniques were employed to realize an advanced and effective skeletal muscle model. A meso-scale functional myobundle based on human myotubes was generated on a custom-made platform. Notably, stromal cells, including fibroblasts, endothelial cells, and macrophages, were integrated to form a stromal compartment, which is crucial for investigating muscle fibrosis. An electrical stimulation system was developed to achieve active contraction of the myobundle. Additionally, the myobundle anchoring system was mechanically characterized to non-invasively quantify the force generated by the construct, allowing for functional assessments. The engineered modular setup resulted in a robust model with the potential for scalability. To validate the system as an effective tool for investigating muscle fibrosis mechanisms, two studies were conducted. First, a Duchenne fibrosis model was created by introducing fibroblasts derived from Duchenne dystrophic patients. This model was used to study the impact of fibrotic fibroblast accumulation on muscle contraction. The results demonstrated a direct reduction in muscle force with an increase in collagen production by fibrotic fibroblasts. Furthermore, the model was extended to study Endothelial-Mesenchymal Transition (EndoMT) in the context of fibrosis and inflammation. Models of Duchenne fibrosis and Inflammation, the latter based on M1 macrophages, were developed. These models included microvascular endothelial cells to observe the relationship between EndoMT and the surrounding environment. Early signs of EndoMT were detected in both conditions. This research aims to enhance our understanding of muscle fibrosis and inspire novel therapeutic approaches based on 3D in vitro modeling, a powerful method for recreating architectural, structural, and functional muscle properties in an engineered and informative setting for the understanding of specific mechanisms.

La fibrosi muscolare scheletrica è una condizione patologica associata a diverse patologie muscolari, come distrofie e laminopatie, ma anche a traumi e invecchiamento. Il suo risultato più evidente è l’accumulo eccessivo di matrice extracellulare all’interno dei muscoli, il quale porta alla compromissione della regolare funzionalità del muscolo. A causa della sua correlazione con la patologia principale e dell’implicazione di numerosi fattori biochimici e biofisici, la fibrosi muscolare rappresenta una sfida significativa nella ricerca muscoloscheletrica. Inoltre, l’assenza di opzioni terapeutiche specifiche sottolinea l’urgente necessità di una migliore comprensione dei meccanismi patologici per consentire un loro trattamento. Riconoscendo i notevoli vantaggi offerti dalla modellizzazione in vitro tridimensionale, lo sviluppo di modelli muscolari scheletrici in vitro più affidabili e completi potrebbe fornire nuove prospettive su questa patologia. Questa tesi si concentra sullo sviluppo di un avanzato modello in vitro tridimensionale del muscolo scheletrico umano. In questo lavoro, sono state impiegate tecniche di biofabbricazione per realizzare un modello avanzato ed efficace di muscolo scheletrico. È stato generato un miofascio funzionale, mesoscala, basato su miotubi umani su una piattaforma appositamente progettata. Particolarmente significativa è stata l’introduzione di cellule stromali, tra cui fibroblasti, cellule endoteliali e macrofagi, per formare un compartimento stromale, fondamentale per indagare sulla fibrosi muscolare. È stato sviluppato un sistema di stimolazione elettrica per ottenere la contrazione attiva del miofascio. Inoltre, il sistema di ancoraggio del miofascio è stato caratterizzato meccanicamente per quantificare la forza generata dalla struttura con un approccio non invasivo, consentendo valutazioni funzionali. La configurazione modulare ingegnerizzata ha prodotto un modello solido con potenziale di scalabilità. Per convalidare il sistema come strumento efficace all’analisi dei meccanismi della fibrosi muscolare, sono stati condotti due studi. In primo luogo, è stato creato un modello di fibrosi di Duchenne introducendo fibroblasti derivati da pazienti affetti da distrofia di Duchenne. Questo modello è stato utilizzato per studiare l’impatto dell’accumulo di fibroblasti fibrotici sulla contrazione muscolare. I risultati hanno dimostrato una riduzione diretta della forza muscolare concomitante all’aumento della produzione di collagene da parte, causata dalla presenza di fibroblasti fibrotici. Inoltre, il modello è stato esteso allo studio della Transizione Endotelio-Mesenchimale (EndoMT) nel contesto della fibrosi e dell’infiammazione. Sono stati sviluppati modelli di fibrosi di Duchenne e di infiammazione, quest’ultimo basato su macrofagi M1. Questi modelli includevano cellule endoteliali microvascolari per osservare la relazione tra EndoMT e l’ambiente circostante. Sono stati rilevati segni precoci di EndoMT in entrambe le condizioni. Questa ricerca mira a migliorare la nostra comprensione della fibrosi muscolare e a ispirare nuovi approcci terapeutici basati sulla modellizzazione in vitro tridimensionale, una potente tecnologia atta a ricreare le proprietà architettoniche, strutturali e funzionali dei muscoli in un contesto ingegnerizzato e informativo per la comprensione di specifici meccanismi.