Progettazione, prototipazione e caratterizzazione di un bioreattore meccanico per la rigenerazione del tendine

Tendon is a connective tissue interposed between muscles and bones and allows to transmit, distribute and scale the forces that the muscles exert on the skeleton system in order to make movement possible. Consequently, tendon is a tissue subjected to very high stresses and is characterized by an high tensile strength. Tendon, however, is also a tissue with limited regenerative abilty for its limited vascularization and oxygen consumption, therefore in event of injury it is unable to regenerate, at least in the short term. In addition, because of its role, tendon injuries can drastically reduce the quality of life of the patient. Every year millions of people subjected to injuries of tendons or ligaments are forced to resort to surgery [1]. Depending on the severity of the injury, the patient's age and any other associated diseases, treatment may include immobilization, rehabilitation, and surgery in severe cases. There are several surgical techniques for correction of tendon injuries, by suturing techniques for the reapposition of the extremities reaffixing to the reconstruction mediated by biological or synthetic grafts. These techniques, however, are subject to important limitations such as the lack of material available, the risk of compromise an healthy tendon or the risk of immune response, also because of its poor regenerative capacity often reconstructed tendon mechanical properties are much lower than normal. In recent years, the traditional techniques have been joined by new approaches in the hope of the regeneration of the tendon, one of the most promising of these is tissue engineering. The present work is placed in this context, having as its objective the design of a low-cost bioreactor capable of applying a stimulation of cyclic strain on cell constructs in order to encourage the production of bioartificial tissue with mechanical and biochemical properties as more similar to those of native tissue, in particular, this bioreactor was born to engineer tendon tissue in vitro. Starting from the study of regulations governing the production of devices in tissue engineering, the general principles on which it is based and state of the art, it has come to define the design specifications that can be summarized as follows: • be compatible with the laboratory procedures (GLP) • have a small size • be disposable or sterilizable • be simple to implement and use • be resistant to corrosion • allow a mechanical stimulation of cyclic tensile on biological constructs • allow to set the parameters of stimulation in simple way • allow to stimulate mare samples in parallel • be flexible Starting from the study of the state of the art was also chosen the stimulation protocol that bioreactor have to impose, which provides: • preload of 3% • deformation of 10% • stimulation frequency rate set at: 0.5 - 1 - 2 Hz • alternation of phases of stimulation / rest: 10/05/15 minutes / hours Most of the bioreactors developed for tendon tissue are very similar to each other regarding the implementation system, in the way that apply mechanical stimulation to the cell samples. In fact, almost all provide a crossbar fixed and one free to move, which are mounted on the sample grips, and the sliding bar is moved by a motor through the mechanical arms. This type of implementation need direct access to the culture chamber for mechanical arms, by through holes isolated with deformable diaphragms or gasket which separates the outer part of the arm from inside pert into the culture chamber. The aseptic culture environment in the long term is therefore a critical aspect of these reactors. To overcome this problem we decided to use magnetic forces to stimulate the samples because they have the advantage of acting at a distance and then you can exert a force sufficient to stretch the samples placed inside the culture chamber while the latter completely isolated from the outside environment and therefore sterile. This allowed us to use it as a common culture chamber for cell culture plate, called Petri dish disposable 15 cm in diameter. The design of the device has been divided into two phases. The initial phase of preliminary design, in which starting from the design specifications have been defined the elements of the bioreactor and which contribute to the proper performance of his duties and which ended with the creation of CAD models of the device. In the next phase of prototyping, we realized, with time and very low cost, a prototype, ie a product test, which tests and analysis were performed to identify problems and errors in the device are difficult to predict at the design stage. In this way, each time refining the prototype has come to define the configuration and then the final construction solution. The preliminary design was developed by decomposing the bioreactor into two blocks: the mechanical locking mechanism and the control block. The mechanical lock comprises the main body of the device, which has the task of allowing the housing of the cell constructs and through which is applied to the pattern of stimulation chosen, the magnetic actuation system, which generates the force required to stretch the samples and support on which is mounted outside the bioreactor. The main body includes two bars, one fixed and one mobile, on which are mounted the scaffold. The beam is kept fixed that, thanks to a ferromagnetic screw, screwed to the body of the crossbar, and a permanent magnet placed outside and in contact with the Petri dish. The crosshead slides along two guides connected to the fixed beam and moves under the influence of the force generated by a second permanent magnet which is periodically approached and removed from Petri. The movement of the crosshead is controlled by suitable mechanical locks placed on the guides who have the responsibility to regulate the race and cross through two compression springs, back in this position when the magnet is removed from the petri dish. The shift imposed on the material on which cells are seeded is then determined by the relative distance between the fixed side and mobile side. The movements of the magnet are generated by an electromagnet in the mantle that moves a piston back and forth depending on whether or not powered by the flow of current. The gripping system of the samples seeded with cells was designed to give the bioreactor a remarkable versatility. On fixed and mobile beams have been obtained in the quarries of which are inserted the grips, this gives the possibility to use different types, such as mechanical, to suture, gluing, just have suitable dimensions to be included in quarries. The gripping system adopted in this thesis is magnetic, and is based on the compression of the construct of a permanent magnet, covered with biocompatible silicone elastomer (PDMS, Sylgard 184 Dow Corning) and a metal plate in stainless steel. The control block, which is responsible for driving the electromagnet to frequency and duration chosen, consists of a card that Arduino2009 appropriately programmed, the pilot via a digital output pin of a transistor that has the task of delivering the necessary current to energize the coil of the electromagnet. The transistor is basically working as a switch turning on and off the electromagnet to the desired frequency. The user interface consists of an LCD display, controlled by the same Arduino board, and the buttons through which you can choose and set the parameters of stimulation in a simple and intuitive way. In the prototype phase, starting from three-dimensional CAD drawings, we created a prototype of the bioreactor using a CAM software for the machine instructions (G-code) capable of controlling a numerically controlled milling machine (CNC). This allowed us to highlight and resolve, from time to time mistakes made in the design phase, and the materials chosen initially to realize the various parts, which have been shown unable to withstand the wash cycle or showed obvious signs corrosion when placed in contact with the culture medium in the atmosphere of the incubator (37 ° C, 5% CO2 saturated with water vapor). In this way we arrived at the definition of the final configuration and functioning of the bioreactor (shown in Figure I), where the bars were made of polycarbonate, the elements of the mechanical locking stainless steel AISI 316L, while the ferromagnetic screws, the ones that showed less resistance to corrosion, have been made of AISI 420 incorporated into the polycarbonate in order to isolate it from the culture. The external support, necessary for the proper positioning of the culture chamber, the permanent magnet and electromagnet, was, however, made with the materials available at the workshop of the LABS, and consists of an extruded aluminum that has grooves along the which is free to slide a guide, also in aluminum, which is mounted on the electromagnet blanket. This makes it possible to move the magnet along the support to adjust the distance between the permanent magnet and the Petri dish and then change the distance of interaction with the moving crosshead. To reduce the vibrations caused by movement of the piston, which may damage cells when transmitted to the culture chamber, vibration of the legs were used to isolate the base of the electromagnet. On the device, several tests were performed: mechanical characterization of the scaffold to be used, characterization of the force of attraction between magnets and screws ferromagnetic adopted, evidence of corrosion, vibration and temperature measurement, kinematic analysis and evaluation of the device delays between the control electronics and mechanical implementation at various frequencies. The tests were very useful to analyze at an early stage, the performance of the bioreactor and then verify the achievement of the goals placed at the design stage. Finally, to make a preliminary biological evaluation of the bioreactor and make sure that the stimulation is done in sterile conditions and that introducing subtle factors that can damage cells has been tested for tissue culture cell line MG 63, and samples were stimulated subjected to a qualitative test to evaluate the MTT metabolic activity compared to a control consisting of a sample kept in static culture conditions. In addition, all samples were subjected to histological examination (Masson trichrome staining) to get information about arrangement of the cells in relation to the scaffold and the production of extracellular matrix. The viability test carried out in this first biological validation is purely qualitative and is based solely on observation of the color taken from the samples for the laboratory where the test has been performed as yet have a spectrophotometer and has not been possible to continue with phase quantitative MTT assay. The MTT test was performed in two stages: static culture after 48 hours (T0) and after 67h and on the other statically cultivated scaffolds (control group) than on the scaffold bioreactor stimulated with 1 Hz for 5 minutes / hours. The results show that cells grown in the bioreactor are viable and have high metabolic activity, and therefore does not damage the bioreactor the cells will cause contamination of the crop. Histology performed at T0 shows that the cells began to produce collagen. Histology performed on the control group to 115 hours of static culture shows that the amount of collagen found is qualitatively superior compared to T0, the staining of collagen also seems more intense. Finally, the results of histology performed on the samples stimulated cycles for 67 hours at 1 Hz for 5 minutes / hours after 48h of static culture shows no differences from the static case, probably the reduced time taken for this first crop validation cell, made more than anything else to verify the survival of cells in the bioreactor and the maintenance of sterility, not allowed to see much difference. Compared with other bioreactors used for this purpose, we have designed a bioreactor extremely simple to implement and use. The chance to use the magnetic forces as a delivery system, has allowed us to produce a device that does not require direct access to the culture chamber thus ensuring the sterility of culture conditions. In this way the part of the bioreactor in direct contact with cells, can be easily accomplished with very low costs and thus is considered conveniently disposable, respecting the regulations governing the application of engineered human constructs. The second part of the bioreactor, the system of implementation and control, is completely decoupled from the first and can be used many times thereby reducing the cost of purchasing the system. The bioreactor has several important limitations, however, including some uncertainty about the actual amount of deformation and the inability to change the tax rate and extent of the deformation once the crop has started. Despite this the results provided by the preliminary validation tests were positive, the bioreactor also provides ample room for future development but will need to make a large experimental campaign which would better characterize the response of cells to mechanical stimuli imposed by the bioreactor.

Il tendine è un tessuto connettivo interposto tra muscoli ed ossa e consente di trasmettere, distribuire e graduare le forze che i muscoli esercitano sull’ apparato scheletrico in modo da rendere possibile il movimento. Il tendine quindi è un tessuto sottoposto a sollecitazioni molto elevate, per esempio 110 MPa nel caso del tendine di Achille (Butler et al., 1978), ed è caratterizzato da un elevata resistenza a trazione. Il tendine però è anche un tessuto con scarse capacità rigenerative essendo scarsamente vascolarizzato e con un consumo di ossigeno piuttosto ridotto quindi in caso di lesioni non è in grado di rigenerarsi, almeno in tempi brevi. Inoltre a causa della funzione che svolge, eventuali lesioni a carico del tendine possono ridurre drasticamente la qualità della vita del paziente. Ogni anno sono milioni le persone soggette a lesioni dei tendini o dei legamenti costrette a ricorrere ad intervento chirurgico [1]. Le cause di lesioni ai tendini possono essere diverse, normalmente incorrono in soggetti, quali gli sportivi, che svolgono attività che sottopongono questi tessuti a carichi eccessivi, ma possono essere causate anche da eventi traumatici, dall’invecchiamento o da patologie degenerative. In funzione della gravità della lesione, dell’età del paziente e di eventuali altre patologie associate, il trattamento può prevedere immobilizzazione, riabilitazione e nei casi più gravi intervento chirurgico. Esistono svariate tecniche chirurgiche per la correzione delle lesioni tendinee, da tecniche di sutura per la riapposizione delle estremità alla ricostruzione mediate tessuti biologici o sintetici. Queste tecniche però sono soggette ad importanti limitazioni. Negli ultimi anni quindi alle tecniche tradizionali si sono affiancati nuovi approcci nella speranza di ottenere la rigenerazione del tendine, tra questi uno dei più promettenti è quello dell’ingegneria dei tessuti. Il presente lavoro di tesi si colloca in questo contesto, avendo come obbiettivo la progettazione di un bioreattore a basso costo capace di applicare una stimolazione di trazione ciclica su dei costrutti cellulari allo scopo di favorire la produzione di tessuto bioartificiale dotato di proprietà meccaniche e biochimiche quanto più simili a quelle del tessuto nativo; in particolare questo bioreattore nasce per ingegnerizzare in vitro il tessuto tendineo. Partendo dallo studio delle normative che regolano la produzione di dispositivi nell’ambito dell’ingegneria tessutale, dei principi generali su cui essa si fonda e dello stato dell’arte, si è arrivati alla definizione delle specifiche di progetto che possono essere riassunte in: • essere compatibile con le procedure di laboratorio (GLP) • avere un ingombro ridotto • essere monouso oppure sterilizzabile • essere semplice da realizzare e da utilizzare • essere resistente alla corrosione • consentire la stimolazione meccanica a trazione ciclica dei costrutti biologici • permettere di impostare i parametri della stimolazione in maniera semplice • consentire di stimolare più campioni in parallelo • essere versatile A partire dallo studio dello stato dell’arte è stato scelto anche il protocollo di stimolazione che il bioreattore avrebbe dovuto imporre, che prevede: • precarico del 3% • deformazione del 10 % • frequenza di stimolazione impostabile a: 0.5 – 1 – 2 Hz • alternanza delle fasi di stimolazione/riposo: 5-10-15 minuti/ora La maggior parte dei bioreattori sviluppati per il tessuto tendineo sono molto simili tra loro per quanto riguarda il sistema di attuazione, nel modo in cui cioè applicano la stimolazione meccanica ai campioni cellulari. Quasi tutti infatti prevedono una traversa fissa ed una mobile, su cui sono montati gli afferraggi per i campioni, e quest’ultima viene mossa da un motore tramite alberi e bracci meccanici. Questa tipologia di attuazione necessità un accesso diretto alla camera di coltura per i bracci meccanici, tramite fori passanti isolati da guarnizioni oppure l’utilizzo di diaframmi deformabili che isolano la parte esterna del braccio da quella interna alla camera di coltura. L’asetticità della camera di coltura a lungo termine è, quindi, un aspetto critico di questi bioreattori. Per ovviare a questo problema abbiamo pensato di utilizzare le forze magnetiche per stimolare i campioni poiché hanno il grosso vantaggio di agire a distanza e quindi è possibile esercitare una forza sufficiente a stirare i campioni posti all’interno della camera di coltura mantenendo quest’ultima completamente isolata dall’ambiente esterno e quindi sterile. Questo ci ha permesso si utilizzare come camera di coltura una comune piastra per colture cellulari, detta “piastra di Petri” monouso da 15 cm di diametro. La progettazione del dispositivo è stata suddivisa in due fasi. La fase iniziale di progettazione preliminare, nella quale a partire dalle specifiche di progetto sono stati definiti gli elementi che compongono il bioreattore e che concorrono al corretto svolgimento della sua funzione e che si è conclusa con la realizzazione dei modelli CAD del dispositivo. Nella successiva fase di prototipazione abbiamo realizzato, con tempi e costi molto contenuti, un prototipo, cioè un prodotto di prova, su cui sono stati eseguiti test ed analisi al fine di individuare problemi ed errori nel dispositivo difficilmente prevedibili in fase di progettazione. In questo modo, perfezionando di volta in volta il prototipo si è arrivati alla definizione della configurazione e quindi della soluzione costruttiva definitiva. La progettazione preliminare è stata sviluppata scomponendo il bioreattore in due blocchi: il blocco meccanico ed il blocco di controllo. Il blocco meccanico comprende il corpo principale del dispositivo, che ha il compito di permettere l’alloggiamento dei costrutti cellulari e attraverso il quale viene applicato il pattern di stimolazione scelto, il sistema di attuazione magnetico, che genera la forza necessaria a stirare i campioni ed il supporto esterno sul quale viene montato il biorettore. Il corpo principale comprende due traverse, una fissa ed una mobile, su cui vengono montati gli scaffold. La traversa fissa viene mantenuta tale grazie ad una vite ferromagnetica, avvitata al corpo della traversa, e ad un magnete permanente collocato all’esterno ed a contatto della Petri. La traversa mobile scorre lungo due guide collegate alla traversa fissa e si muove sotto l’effetto della forza generata da un secondo magnete permanente che viene ciclicamente avvicinato ed allontanato dalla Petri. Il movimento della traversa mobile viene regolato da opportuni blocchi meccanici inseriti sulle guide che hanno il compito di regolare la corsa della traversa e, tramite due molle a compressione, riportare quest’ultima nella posizione di riposo quando il magnete viene allontanato dalla petri. Lo spostamento imposto al materiale su cui sono seminate le cellule è quindi stabilito dalla distanza relativa tra lato fisso e lato mobile. I movimenti del magnete sono generati da un elettromagnete a mantello che muove in avanti e indietro un pistone a seconda che sia o meno alimentato dal passaggio di corrente. Il sistema di afferraggio dei campioni seminati con le cellule è stato progettato in modo da conferire al bioreattore una notevole versatilità. Sulle traverse fissa e mobile sono state ricavate delle cave all’interno delle quali vengono inseriti gli afferraggi, questo per dare la possibilità di utilizzarne diverse tipologie, ad esempio meccanici, a sutura, ad incollaggio, basta che abbiano dimensioni esterne idonee ad essere inseriti nelle cave. Il sistema di afferraggio adottato in questo lavoro di tesi è di tipo magnetico, e si basa sulla compressione del costrutto tra un magnete permanente, rivestito in elastomero siliconico biocompatibile (PDMS, Sylgard 184 Dow Corning) e una piastrina metallica in acciaio inox. Il blocco di controllo, che ha il compito di pilotare l’elettromagnete alla frequenza e per la durata scelte, è costituito da una scheda Arduino2009 che opportunamente programmata, pilota tramite un pin di output digitale un transistor che ha il compito di erogare la corrente necessaria ad alimentare la bobina dell’elettromagnete. Il transistor fondamentalmente funziona come un interruttore accendendo e spegnendo l’elettromagnete alla frequenza desiderata. L’interfaccia utente è costituita da un display LCD, controllato dalla stessa scheda Arduino, e da dei pulsanti tramite i quali è possibile scegliere ed impostare i parametri della stimolazione in maniera semplice ed intuitiva. Nella fase di prototipazione, a partire dai disegni CAD tridimensionali, abbiamo realizzato il prototipo del bioreattore utilizzando un software CAM per ottenere le istruzioni macchina (G-Code) idonee a comandare una fresatrice a controllo numerico (CNC). Questo ci ha permesso di mettere in luce e di risolvere, di volta in volta gli errori commessi in fase di progettazione, ed ai materiali scelti inizialmente perrealizzare le varie parti , che si sono mostrati incapaci di reggere ai cicli di autolavaggio o hanno mostrato evidenti segni di corrosione quando posti a contatto col medium di coltura nell’atmosfera dell’incubatore (37°C, 5% CO2, saturazione di vapore acqueo). In questo modo si è arrivati alla definizione della configurazione definitiva e funzionante del bioreattore (mostrata in figura I), in cui le traverse sono state realizzate in policarbonato, gli elementi del blocco meccanico in acciaio inox AISI 316L, mentre le viti ferromagnetiche, quelle che hanno mostrato minore resistenza alla corrosione, sono state realizzate in AISI 420 inglobato nel policarbonato in maniera da isolarlo dall’ambiente di coltura. Il supporto esterno, necessario al corretto posizionamento della camera di coltura, del magnete permanente e dell’elettromagnete, è invece stato realizzato con i materiali disponibili presso l’officina del LaBS, ed è costituito da un profilato estruso in alluminio che presenta delle scanalature lungo le quali è libera di scorrere una guida, anch’essa in alluminio, sulla quale viene montato l’elettromagnete a mantello. In questo modo è possibile muovere l’elettromagnete lungo il supporto in modo da regolare la distanza tra il magnete permanente e la Petri e quindi modificare la distanza di interazione con la traversa mobile. Per ridurre le vibrazioni causate dal movimento del pistone, che potrebbero danneggiare le cellule se trasmesse alla camera di coltura, sono stati utilizzati dei piedini antivibrazione in modo da isolare la base dall’elettromagnete. Sul dispositivo sono stati eseguiti numerosi test: caratterizzazione meccanica degli scaffold da impiegare, caratterizzazione della forza di attrazione tra magneti adottati e viti ferromagnetiche, prove di corrosione, misura della temperatura e delle vibrazioni, analisi cinematica del dispositivo e valutazione dei ritardi tra comando elettronico e attuazione meccanica alle varie frequenze. I test sono stati molto utili al fine di analizzare in fase preliminare, le prestazioni del bioreattore e quindi verificare il raggiungimento degli obbiettivi posti in fase di progettazione. Infine, per effettuare una prima validazione biologica del bioreattore e assicurarsi che la stimolazione avvenga in condizioni di sterilità e che non subentrino fattori che possano danneggiare le cellule è stata eseguita una prova di coltura cellulare con cellule della linea MG 63 ed i campioni stimolati sono stati sottoposti ad un MTT test qualitativo per valutarne l’attività metabolica rispetto ad un controllo costituito da un campione mantenuto in condizioni di coltura statica. Inoltre tutti i campioni sono stati sottoposti ad un esame istologico (colorazione Masson Tricromica) per ottenere informazioni circala disposizione delle cellule in relazione allo scaffold e sulla produzione di matrice extracellulare. Il test di vitalità effettuato in questa prima validazione biologica è puramente qualitativo e si basa esclusivamente sull’osservazione della colorazione assunta dai campioni perché il laboratorio in cui il test è stato eseguito non dispone ancora di uno spettrofotometro e non è stato possibile proseguire con la fase quantitativa del MTT test. L’MTT test è stato eseguito in due momenti: dopo 48h di coltura statica (tempo T0) e dopo altre 67h sia sugli scaffold coltivati staticamente (gruppo di controllo) che sugli scaffold stimolati col bioreattore a 1 Hz per 5 minuti/ora. I risultati mostrano che le cellule coltivate nel bioreattore sono vitali e dotate di intensa attività metabolica, e che quindi il bioreattore non danneggia le cellule ne causa contaminazioni della coltura. L’istologia eseguita al tempo T0 mostra che le cellule hanno cominciato a produrre collagene. L’istologia eseguita sul gruppo di controllo a 115 ore di coltura statica mostra che la quantità di collagene riscontrata è qualitativamente superiore rispetto al T0, la colorazione del collagene sembra inoltre più intensa. Infine il risultato dell’istologia eseguita sui campioni stimolati ciclicamente per 67 ore a 1 Hz per 5 minuti/ora dopo 48h di coltura statica non mostra particolari differenze rispetto al caso statico, probabilmente il ridotto tempo di coltura adottato per questa prima validazione cellulare, fatta più che altro per verificare la sopravvivenza delle cellule nel bioreattore ed il mantenimento della sterilità, non ha consentito di scorgere particolari differenze. Paragonato ad altri bioreattori utilizzati a tale scopo, il bioreattore da noi progettato è estremamente semplice da realizzare e da utilizzare. Il fatto di sfruttare le forze magnetiche come sistema di attuazione, ci ha permesso di realizzare un dispositivo che non richiede l’accesso diretto alla camera di coltura garantendo così l’asetticità delle condizioni di coltura. In questo modo la parte del bioreattore a diretto contatto con le cellule, può essere facilmente realizzata con costi molto contenuti e quindi è considerabile convenientemente monouso, rispettando le normative che regolano l’applicazione di costrutti ingegnerizzati sull’uomo. La seconda parte del bioreattore, il sistema di attuazione e controllo, è totalmente disaccoppiata dalla prima e può essere utilizzata infinite volte riducendo così i costi di acquisto del sistema. Il bireattore presenta però alcuni importanti limiti, tra i quali una certa incertezza circa l’effettiva entità della deformazione imposta e l’impossibilità di modificare la velocità e l’entità della deformazione una volta che la coltura è iniziata. Nonostante questo i risultati forniti dai test di validazione preliminare sono risultati positivi, inoltre il bioreattore offre ampi margini di sviluppo futuri ma sarà necessario effettuare un ampia campagna sperimentale atta a caratterizzare meglio la risposta delle cellule agli stimoli meccanici imposti dal bioreattore.