Brillouin microscopy with closed-loop controlled birefringence-induced phase delay optical filter

Brillouin Spectroscopy is a non-invasive and label-free technique to study the visco-elastic properties of material. Exploiting Brillouin spectroscopy for biomedical application has gained a momentum in the recent years thanks to the spectroscopic schemes exploiting tandem multi-pass Fabry-Perot and multipass VIPA spectrometers. The underlying challenge in adopting the Brillouin spectroscopy as a reliable method to study bio-mechanical properties of in vivo tissue, lies in high acquisition speed and high spectral resolution requirements which is limited by low signal to background ratio. A novel perspective introduced by G. Antonacci et al. is to extinguish the background signal by placing a common-path Birefringence-Induced Phase Delay (BIPD) filter before a single-stage VIPA spectrometer. The working principle of the BIPD filter is based on introducing an orthogonal polarization state to the background signal with respect to the Brillouin signal by using a birefringent material and eventually filtering it out based on its different polarization state. BIPD filter being an effective, common path, and reliable technique, requires further stability considerations to operate at the optimum performance because of the inherent thermal sensitivities. In this work we built a closed-loop feedback system to optimize the stability and keep the performance of the filter at the desired level during long acquisition times. Furthermore, we studied the underlying instability issues of the BIPD filter by measuring the thermal dependence of the output polarization of background signal thanks to the closed-loop system. Having understood the instability pattern, we numerically simulated our filter using Jones matrices to understand the theoretical causes of the instability to eliminate or to reduce the instabilities in the filter. As a proof of concept, we performed measurements on spheroids and highly turbid bone samples. In this thesis we successfully implemented a completely automated feedback system to effectively and reliably improve the stability of the BIPD filter which resulted in increased acquisition speeds and higher signal to background ratio in Brillouin micro-spectroscopy which was tested on extreme conditions to obtain high quality Brillouin maps. The performed measurements on spheroids and particularly highly turbid bone samples for the study of Osteopetrosis revealed the effectiveness of our approach.

La spettroscopia di Brillouin è una tecnica non invasiva e senza etichette per studiare le proprietà viscoelastiche dei materiali. Negli ultimi anni, l’applicazione biomedica della spettroscopia di Brillouin ha guadagnato slancio grazie a schemi spettroscopiche come gli spettrometri multi-pass tandem Fabry-Perot e gli VIPA a passaggi multipli. La sfida principale nell’adozione della spettroscopia di Brillouin come metodo affidabile per lo studio delle proprietà biomeccaniche dei tessuti in vivo risiede nella necessità di una velocità di acquisizione elevata e di una elevata risoluzione spettrale, limitata dal basso rapporto segnale-rumore. Una prospettiva innovativa introdotta da G. Antonacci et al. è quella di eliminare il segnale di fondo posizionando un filtro Birefringence-Induced Phase Delay (BIPD) a percorso comune prima di uno spettrometro single-stage VIPA. Il principio di funzionamento del filtro BIPD si basa sull’introduzione di uno stato di polarizzazione ortogonale al segnale di fondo rispetto al segnale di Brillouin utilizzando un materiale birifrangente e, alla fine, filtrandolo in base al suo diverso stato di polarizzazione. Il filtro BIPD, essendo una tecnica efficace, a percorso comune e affidabile, richiede ulteriori considerazioni di stabilità per operare alle prestazioni ottimali a causa delle sensibilità termiche intrinseche. In questo lavoro abbiamo costruito un sistema di closed-loop feedback per ottimizzare la stabilità e mantenere le prestazioni del filtro al livello desiderato durante lunghe acquisizioni. Inoltre, abbiamo studiato i problemi sottostanti di instabilità del filtro BIPD misurando la dipendenza termica della polarizzazione del segnale di fondo grazie al sistema a closed-loop. Avendo compreso il modello di instabilità, abbiamo simulato numericamente il nostro filtro utilizzando le matrici di Jones per comprendere le cause teoriche dell’instabilità al fine di eliminarle o ridurle. Come prova di concetto, abbiamo effettuato misurazioni su sferoidi e campioni ossei estremamente torbidi. In questa tesi abbiamo implementato con successo un sistema di feedback completamente automatizzato per migliorare in modo efficace e affidabile la stabilità del filtro BIPD, il che ha comportato un aumento della velocità di acquisizione e un maggiore rapporto segnalerumore nella microspettroscopia di Brillouin, testato in condizioni estreme per ottenere mappe di Brillouin di alta qualità. Le misurazioni effettuate su sferoidi e in particolare su campioni ossei estremamente torbidi per lo studio dell’osteopetrosi hanno dimostrato l’efficacia del nostro approccio.