A microfluidic approach to assess the effect of cytoskeletal drugs on platelet aggregation

Platelets are small cells that circulate in the bloodstream and are involved in the process of hemostasis, which is the prevention or cessation of bleeding. Platelets activation, triggered by various stimuli, induces significant shape changes driven by cytoskeletal structures. Understanding how alterations in cytoskeletal dynamics might impact hemostasis mechanisms could be crucial for therapy planning. Hence, the aim of this study was to investigate the side effects of three platelet cytoskeletal modulators on the aggregation process using a novel microfluidic platform. This microfluidic system allowed the real-time observation of platelet behavior in response to a shear force characteristic of large arterial vessels and collagen, a key extracellular matrix protein. This approach accurately replicates anatomical conditions, requiring few time and a small blood volume. Hirudin-anticoagulated blood, both in the absence and presence of drugs at different concentrations, was perfused at a shear level of 49.5 dyne/cm² on a collagen-coated microchannel. Platelet activity was observed for 4 minutes using a fluorescence microscope. At the end of each run, four parameters and their respective kinetics were analyzed: surface coverage, number of thrombi, mean thrombus area, and mean fluorescence intensity. The morphological changes of platelets under drugs effects were also studied using flow cytometry. The study has revealed how platelet aggregation is influenced by agents modulating cytoskeletal dynamics at varying concentrations. Particularly, alterations were observed in the parameters and kinetics of mean thrombus area and mean fluorescence intensity following drug administration compared to the control. Specifically, the presence of cytoskeletal dynamics inhibitors such as demecolcine and cytochalasin B led to a decrease of these aggregation measures, differently from the case where paclitaxel, a potent stabilizer of cytoskeletal microtubules, was administered. In the latter scenario, mean thrombus area values at the highest chosen concentration significantly increased, resulting in the formation of larger aggregates compared to the control. Additionally, cytofluorimetric analyses revealed that aggregate sizes and their nuclear and surface complexity were lower when the two cytoskeletal dynamics inhibitors were employed, and higher after paclitaxel effect. Despite many interesting findings, there is a need to deepen the understanding of the role of the cytoskeleton modifications and the impact of its modulators in platelet functionality and hemostatic processes. The microfluidic platform, designed for observing platelet adhesion and thrombus growth on surfaces coated with adhesive proteins, has emerged as a valuable tool for advancing the research in hemostasis and thrombosis.

Le piastrine sono piccole cellule che circolano nel flusso sanguigno e sono coinvolte nel processo di emostasi, che compete nella prevenzione o cessazione del sanguinamento. L'attivazione delle piastrine, innescata da vari stimoli, induce in esse significativi cambiamenti di forma guidati dalle strutture citoscheletriche. Comprendere come le alterazioni della dinamica citoscheletrica possano influenzare i meccanismi emostatici potrebbe essere cruciale per la pianificazione delle terapie. Pertanto, lo scopo di questo studio era quello di investigare gli effetti collaterali di tre modulatori citoscheletrici delle piastrine sul processo di aggregazione utilizzando una nuova piattaforma microfluidica. Questo sistema microfluidico ha consentito l'osservazione in tempo reale del comportamento delle piastrine in risposta a una forza di taglio caratteristica dei grandi vasi arteriosi e al collagene, una proteina fondamentale della matrice extracellulare. Questo approccio replica accuratamente le condizioni anatomiche, richiedendo poco tempo e un limitato volume di sangue. Il sangue anticoagulato con l'irudina, sia in assenza che in presenza di farmaci a diverse concentrazioni, è stato perfuso a un livello di taglio di 49.5 dyne/cm² su un microcanale rivestito di collagene. L'attività piastrinica è stata osservata per 4 minuti utilizzando un microscopio a fluorescenza. Alla fine di ogni esperimento, quattro parametri e le rispettive cinetiche sono stati analizzati: copertura superficiale, il numero di trombi, l'area media del trombo e l'intensità media della fluorescenza. Le modifiche morfologiche delle piastrine sotto l'effetto dei farmaci sono state anche studiate utilizzando la citometria a flusso. Lo studio ha rivelato come l'aggregazione delle piastrine sia stata influenzata dagli agenti che modulano la dinamica citoscheletrica a diverse concentrazioni. In particolare, sono state osservate alterazioni nei parametri e nelle cinetiche dell'area media del trombo e dell'intensità media della fluorescenza dopo l'amministrazione del farmaco rispetto al controllo. La presenza di inibitori della dinamica citoscheletrica come la demecolcina e la citochalasina B ha portato a una diminuzione di queste misure di aggregazione, diversamente dal caso in cui è stato somministrato il paclitaxel, un potente stabilizzatore dei microtubuli citoscheletrici. In quest'ultimo scenario, i valori dell'area media del trombo alla concentrazione più alta scelta sono aumentati significativamente, con la formazione di aggregati più grandi rispetto al controllo. Inoltre, le analisi citofluorimetriche hanno rivelato che le dimensioni degli aggregati e la loro complessità nucleare e superficiale erano inferiori quando venivano impiegati i due inibitori della dinamica citoscheletrica e superiori dopo l'effetto del paclitaxel. Nonostante molti risultati interessanti, c'è bisogno di approfondire la comprensione del ruolo delle modifiche del citoscheletro e dell'impatto dei suoi modulatori sulla funzionalità delle piastrine e sui processi emostatici. La piattaforma microfluidica, progettata per osservare l'adesione delle piastrine e la crescita dei trombi su superfici rivestite con proteine adesive, si è rivelata uno strumento valido per avanzare nella ricerca in emostasi e trombosi.