Valutazione dell'attivazione piastrinica di dispositivi per la circolazione extracorporea mediante flow loop e platelet activity state assay

Extracorporeal circulation (ECC) systems, such as cardiopulmonary bypass (CPB) and extracorporeal membrane oxygenator (ECMO), are crucial in supporting patients with severe cardiac dysfunction. However, the high presence of artificial materials and their non-physiological haemodynamic cause thrombus formation, representing a serious complication. For this reason, there are numerous in vitro studies in the literature evaluating the thrombogenicity of ECC devices such as centrifugal pumps and oxygenators. These studies are based on experiments in dynamic flow circuits to detect platelet activation (PA) induced by shear stress over time. The Platelet Activity State (PAS) assay is a simple and reliable test developed specifically to assess this pathway, since, based on thrombin formation, it offers a direct relationship between shear stress and PA. In the literature, it is combined with small flow loops in which gel-filtered platelets (GFP), i.e. isolated from plasma proteins and blood cells, circulate. This has the advantage of studying the effect of shear stresses induced by the device directly on platelets, without additional activation caused by the influence of other blood cells. The aim of the present work is to design and conduct experimental tests, based on flow loop and PAS assay, to evaluate the thrombogenicity of two ECC devices. In the first part, experimental GFP tests are performed, based on those found in the literature, to compare the PA of two adult oxygenators, the Livanova Inspire 6 and the Maquet Quadrox Small Adult, and thus assess the applicability of the PAS assay to large-volume flow loops. The results showed two different dynamics for the respective oxygenators, confirming the adequacy of the experimental set-up and the effectiveness of the PAS assay in discriminating their behaviour. However, limitations were found related to the laboriousness and long times required to filter large amounts of GFP, which affect platelet functionality and generate variability in the samples tested. It has been demonstrated in the literature that platelets can also be filtered downstream of mechanical stimulation by taking small blood samples from patients with cf-VAD. Considering this and following the results obtained, it was hypothesised that the application of the PAS assay to whole blood circuits could overcome the limitations found in GFP. The second part of this study included the development of a simplified flow loop, provided only for a paediatric centrifugal pump, and an experimental protocol to test this hypothesis. Specifically, the flow loop and protocol were designed to perform a subsequent comparison of the thrombogenicity of two pumps, the NewBorn and the Pedimag, using circuits placed in parallel to minimise the timing and use a single blood bag for filling. Centrifuge and filling protocols were also optimised to obtain samples with adequate yield and minimal basal platelet activation. The flow loop and protocols developed were then evaluated in two preliminary experiments, which involved estimating the thrombogenicity of a single pump. The tests demonstrated significant progress in overcoming the limitations previously found in GFP-filled loops. However, the limited number of trials showed different dynamics of platelet activation. This suggested the need for further tests, including the investigation of a presumable decrease in the accuracy of the results, due to the interaction between platelets and blood cells during the experiment and the excessive stimulus frequency they were subjected to. Following these experiments, a circuit modification may be necessary, considering the introduction of a blood bag as a reservoir, to obtain temporal dynamics more consistent with those observed in clinical settings.

I sistemi per la circolazione extracorporea (CEC), quali il bypass cardiopolmonare (CPB) e l’ossigenatore extracorporeo a membrana (ECMO), sono cruciali nel supporto di pazienti con disfunzioni cardiache gravi. Tuttavia, l’elevata presenza di materiali artificiali e l'emodinamica non fisiologica che li caratterizza, causano la formazione di trombi rappresentando una seria complicanza. Per questo motivo, in letteratura sono presenti numerosi studi in vitro che valutano la trombogenicità dei dispositivi della CEC, come pompe centrifughe ed ossigenatori. Questi studi si basano su esperimenti in circuiti di flusso dinamici che permettono di rilevare l’attivazione piastrinica (PA) indotta da sforzi di taglio nel tempo. Il Platelet Activity State (PAS) assay è un test semplice e affidabile, sviluppato specificatamente per valutare questa via di stimolazione, poiché, basandosi sulla formazione di trombina, offre una relazione diretta tra lo sforzo di taglio e la PA. In letteratura viene abbinato a flow loops di dimensioni contenute in cui circolano piastrine gel-filtrate (GFP), ovvero isolate da proteine plasmatiche e cellule del sangue. In questo modo, si ha il vantaggio di studiare l’effetto degli sforzi di taglio indotti dal dispositivo direttamente sulle piastrine, senza attivazioni ulteriori causate dall’influenza delle altre cellule del sangue. Il presente lavoro si pone l’obiettivo di progettare e condurre test sperimentali, basati su flow loop e PAS assay, per valutare la trombogenicità di due dispositivi per CEC. Nella prima parte, vengono eseguiti dei test sperimentali in GFP, basati su quelli trovati in letteratura, per confrontare la PA di due ossigenatori per adulti, il Livanova Inspire 6 e il Maquet Quadrox Small Adult, e valutare quindi l’applicabilità del PAS assay a circuiti di flusso di grandi volumi. I risultati hanno mostrano due dinamiche diverse per i rispettivi ossigenatori, confermando l’adeguatezza del set-up sperimentale e l’efficacia del PAS assay nel discriminarne i comportamenti. Tuttavia, sono state riscontrate delle limitazioni legate alla laboriosità e alle lunghe tempistiche necessarie per filtrare grandi quantità di GFP, che incidono sulla funzionalità piastrinica e generano variabilità dei campioni esaminati. In letteratura è stata dimostrata la possibilità di filtrare le piastrine anche a valle dello stimolo meccanico, prelevando piccoli campioni di sangue da pazienti con cf-VAD. Considerando ciò e a seguito dei risultati ottenuti, è stato ipotizzato che l’applicazione del PAS assay a circuiti in sangue intero potesse superare i limiti riscontrati in GFP. La seconda parte di questo studio ha previsto lo sviluppo di un flow loop semplificato, costituito solo di una pompa centrifuga pediatrica, e un protocollo sperimentale per verificare questa ipotesi. In particolare, il flow loop e il protocollo sono stati ideati per eseguire un successivo confronto della trombogenicità di due pompe, la NewBorn e la Pedimag, tramite circuiti posizionati in parallelo per minimizzare le tempistiche e utilizzare un'unica sacca di sangue per il riempimento. Sono stati inoltre ottimizzati i protocolli di centrifuga e di riempimento per ottenere campioni con una resa adeguata e un’attivazione piastrinica basale minima. Il flow loop e i protocolli sviluppati sono poi stati valutati tramite due esperimenti preliminari, che prevedevano di stimare la trombogenicità di una singola pompa. I test hanno dimostrato un progresso significativo nel superare i limiti precedentemente riscontrati nei circuiti riempiti con GFP. Tuttavia, il numero limitato di prove ha mostrato una diversa dinamica di attivazione piastrinica. Questo ha suggerito la necessità di condurre ulteriori test, comprendendo l’indagine di una presumibile diminuzione dell’accuratezza dei risultati, data dall’interazione tra piastrine e cellule del sangue avvenuta durante l’esperimento e dall’eccessiva frequenza di stimolo a cui sono state sottoposte. A seguito di tali esperimenti, potrebbe rendersi necessaria una modifica circuitale, considerando l’introduzione di una sacca di sangue come serbatoio, al fine di ottenere dinamiche temporali più coerenti con quelle osservate in contesti clinici.