Design and characterization of fluorinated nanoparticles for neural precursor cell tracking by 19F-MRI

Traditional magnetic resonance imaging (MRI) research has represented a milestone in medical diagnostics, allowing detailed observation of body tissues without the use of ionizing radiation. However, traditional MRI has some limitations when it comes to specific applications, especially in the context of cell tracking and visualization of labeled cells. One of the main challenges is that traditional MRI relies on the observation of hydrogen atoms present in biological tissues, which can cause high background signal intensity and can make it difficult to accurately discriminate regions of interest, especially when high levels of detail are needed. To overcome these limitations, researchers have developed a complementary technique to 1H-MRI, 19-fluorine magnetic resonance imaging (19F-MRI), taking advantage of the fact that fluorine is not naturally present in biological tissues, except for some traces in bone. This introduced a new paradigm in cell tracking, eliminating the background signal and allowing more precise reception of labeled cells. 19F-MRI has become a promising solution for cell tracking, especially in applications such as cell therapies and regenerative medicine, where it is essential to follow labeled cells over time. Using fluorine as a contrast agent offers greater specificity and resolution, helping to overcome the challenges that traditional MRI faces in the context of cellular monitoring. Furthermore, it is important to highlight that the signal intensity is directly proportional to the number of F atoms and can be quantified. Specifically, fluorinated probes characterized by magnetically equivalent 19F nuclei, such as perfluorocarbons (PFCs), have been designed. More recently, PERFECTA, a new probe with promising properties in the context of 19F-MRI, was developed. This molecule can be encapsulated within nanoparticles (NPs) based on a biodegradable polymer, poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA), known for its optimal properties for biological applications such as biocompatibility. Therefore, in the present work, two types of PERFECTA-PLGA NPs were used with the intention of labeling and tracking cells. The two PLGA based NPs formulations implemented in this study are coated, respectively, by sodium-cholate (NaC) and chitosan (CS) shells. NaC and CS were employed as coating agents during the formulation process to improve the properties of the obtainedNPs. The first phase of this work was dedicated to the formulation of the mentioned NPs and their characterization using Dynamic Light Scaering (DLS), which allowed the evaluation of size, polydispersity (PDI) and stability. In parallel, fluorine-19 Nuclear Magnetic Resonance (19F-NMR) was used to determine the encapsulation efficiency of PERFECTA and the concentration of fluorine atoms per ml (19F/ml). The results provided the size of the NPs (70 nm for NaC-PLGA-PERFECTA, and 150 nm for CS-PLGA-PERFECTA), characterized by a low PDI (less than 0.25, indicating monodispersivity of the NPs) and high efficiency of PERFECTA encapsulation (E% > 75% with 3.5 ± 0.2 x 1020 19F/ml). The stability of the NPs in cellular biological environments was investigated by DLS, and the formation and kinetics of the protein corona adsorbed in the biological medium were studied by gel electrophoresis. The data obtained highlighted a good colloidal stability of NaC-PLGA during incubation in cell culture media. Such a stability was also associated with a marked growth of the protein corona in the medium. On the contrary, CS-PLGAdid not show significant protein corona formation and their colloidal stability was significantly lower. In the next phase of the work, both formulations were used for labeling tests on human stem cells, in particular Neural Precursor Cell (NPC), widely used in preclinical research focused on the treatment of multiple sclerosis. For in vitro experiments, the NPs were also fluorescently labeled usinga small percentage of PLGA-rhodamineB in their formulation to enable cell tracking, monitor localization and distribution within cells, as well as evaluate internalization using specific fluorescent techniques. During cellular experiments, the NPs were incubated with the cells for a fixed period. Subsequently, cell viability and cell labeling were assessed to understand the effects of NPs on neural stem cells. This approach aims to provide detailed information on the ability of the NPs to interact with human NPC and represents a significant step in the application of these NPs for cell tracking purposes in specific research contexts such as those linked to multiple sclerosis. Cell viability was excellent, with minimal variations compared to the control group. The detection of labeled cells was carried out by flow cytometry (FACS), while the amount of incorporated fluorine atoms was measured by 19F-NMR, being higher for PLGA-NaC than for PLGA-CS. These results highlight a promising cellular uptake efficacy, especially for NaC-PLGA, underlining the potential of using these NPs for applications in cell tracking by 19F-MRI. In order to understand in detail the dynamics of NP-cell interactions, a specific study was conducted to visualize the localization of NPs inside cells using immunofluorescence. The results of this analysis clearly indicated a cytoplasmic localization for both formulations. Furthermore, to confirm these data and strengthen the observation of higher labeling efficiency of PLGA-NaC compared to CS, a RAMAN imaging study was performed. The laer not only confirmed higher labeling efficiency for NaC NPs, but also consolidated the observation of the cytoplasmic localization of the NPs within the cells. Finally, a proliferation assay was conducted with the aim of verifying that the NPs did not negatively influence cell proliferation and evaluating the ability of the cells to retain the internalized NPs in the long term (10 days). The results indicated that NPCs incubated with the NPs did not significantly affect the proliferation rate, suggesting that these NPs do not impair cell growth. Furthermore, a significant decrease in the mean fluorescence intensity (MFI) was observed in the prolonged period compared to the first 24 hours, suggesting a notable loss of nanoparticles (NPs) from the cells. However, despite this, the cells retain the ability to retain a certain amount of nanoparticles even after an extended period of 10 days. According to the promising evidence emerging from in vitro studies conducted on human NPCs, it was considered essential to extend the research to also include in vitro studies on murine stem cells, in particular murine NPCs. The expansion of the research to murine NPCs aims to provide a more complete and representative evaluation of the interaction between NPs and the mentioned cells. This approach is crucial for a possible future application of these NPs in pre-clinical in vivo studies in murine models, considering the validity and relevance of the results obtained in preclinical research. Consequently, in order to deepen the understanding of the interactions between NPs and murine NPCs, preliminary studies were conducted. Both formulations were incubated with the mentioned cells, after which viability, cell labeling and biological interactions were repeatedly examined. The obtained results confirmed preservation of excellent cell viability with both formulations and presence of a more extensive protein corona on PLGA-NaC NPs compared to PLGA-CS NPs. Cell labeling, although comparable between two formulations, requires further investigation through additional studies to gain a complete understanding of the interaction dynamics. The primary aim of this work is to determine which of the two formulations demonstrates beer efficacy in ensuring higher cellular labeling on human and murine stem cells, thus helping to consolidate the choice of the optimal formulation for future applications and in vivo preclinical research. This preliminary phase constitutes a solid basis for future in-depth studies and targeted research. Among next study phases, it is planned to complete the experiments on murine cells with further investigations on cell proliferation and immunofluorescence analysis. Furthermore, a proteomic study will be conducted to identify the proteins involved in the formation of the protein corona, thus providing important details regarding the internalization of NPs by both cell types. In vivo studies are also planned to verify cellular tracking in animals and formulation of NPs capable of delivering a drug for the treatment of multiple sclerosis will be evaluated. These integrated approaches will contribute to a significant increase in knowledge and may open new perspectives for future biomedical applications.

Le ricerche sulla risonanza magnetica (MRI) tradizionale hanno rappresentato una pietra miliare nella diagnostica medica, consentendo l'osservazione dettagliata dei tessuti del corpo senza l'uso di radiazioni ionizzanti. Tuttavia, la MRI tradizionale ha alcune limitazioni quando si tratta di applicazioni specifiche, soprattutto nel contesto del cell tracking e della visualizzazione di cellule marcate. Una delle principali sfide è rappresentata dal fatto che la MRI tradizionale si basa sull'osservazione di atomi di idrogeno presenti nei tessuti biologici, che può causare un'elevata intensità del segnale di fondo e può rendere difficile discriminare con precisione le regioni di interesse, specialmente quando sono necessari elevati livelli di dettaglio. Per superare queste limitazioni, gli studiosi hanno sviluppato una tecnica complementare alla 1H-MRI, la risonanza magnetica al fluoro-19 (19F-MRI), sfruttando il fatto che il fluoro non è naturalmente presente nei tessuti biologici, ad eccezione di qualche traccia nelle ossa. Questo ha introdotto un nuovo paradigma nel monitoraggio cellulare, eliminando il segnale di fondo e consentendo una ricezione più precisa delle cellule marcate. La 19F-MRI è diventata una soluzione promettente per il cell tracking, soprattutto in applicazioni come terapie cellulari e medicina rigenerativa, dove è essenziale seguire le cellule marcate nel tempo. L'utilizzo del fluoro come agente di contrasto offre una maggiore specificità e risoluzione, contribuendo a superare le sfide che la MRI tradizionale affronta nel contesto del monitoraggio cellulare. Inoltre, è importante sottolineare che l’intensità del segnale è direttamente proporzionale al numero di atomi di 19F e può essere quantificata. Nello specifico sono state progettate delle sonde fluorate caratterizzate da nuclei di 19F magneticamente equivalenti, come ad esempio i perfluorocarburi (PFCs). Più recentemente è stata sviluppata PERFECTA, una nuova sonda con proprietà promettenti nel contesto della 19F-MRI. Questa molecola può essere incapsulata all’interno di nanoparticelle (NPs) a base di un polimero biodegradabile, il poliacido(laico-co-glicolico) (PLGA), noto per le sue proprietà ottimali per le applicazioni biologiche come la biocompatibilità. Pertanto, nel presente lavoro, sono state utilizzate due tipologie di NPs a base di PLGA e caricate con PERFECTA (PERFECTA-PLGA) con l’intenzione di etichettare le cellule e seguirle in vivo. Le due formulazioni di NPs implementate in questo studio sono costituite, rispettivamente, da un rivestimento a base di colato di sodio (NaC) e uno a base di chitosano (CS). NaC e CS sono stati impiegati come agenti di rivestimento durante il processo di formulazione per migliorare le proprietà delle NPs. La prima fase di questo lavoro è stata dedicata alla formulazione delle NPs suddee e alla loro caratterizzazione mediante Diffusione di Luce Dinamica (DLS) che ha permesso di valutare dimensioni, polidispersità (PDI) e stabilità colloidale delle NPs. In parallelo, la Risonanza Magnetica Nucleare del Fluoro (19F-NMR) è stata impiegata per determinare l’efficienza di incapsulamento di PERFECTA e la concentrazione di atomi di fluoro per ml (19F/ml). I risultati hanno confermato le dimensioni delle NPs (70 nm per NaC-PLGA-PERFECTA, e 150 nm per CS-PLGA-PERFECTA), una bassa PDI (inferiore a 0,25, indicando monodispersità delle NPs) e un’elevata efficienza di incapsulamento di PERFECTA (E% > 75% con 3,5 ± 0,2 x 1020 19F/ml). La stabilità colloidale delle NPs in ambienti biologici cellulari è stata indagata mediante DLS, e la formazione e la cinetica di formazione della corona proteica adsorbita nel mezzo biologico sono state studiate attraverso elettroforesi su gel. I dati ottenuti hanno evidenziato una buona stabilità colloidale delle NaC-PLGA nel corso di 48 ore di incubazione. Tale stabilità è associata a una marcata crescita della corona proteica nel mezzo. Al contrario, nel caso di CS-PLGA, non è stata riscontrata una significativa formazione di corona proteica e la stabilità colloidale è risultata notevolmente inferiore. Nella fase successiva del lavoro, entrambe le formulazioni sono state sottoposte a test di marcatura su cellule staminali umane, in particolare Neural Precursor Cell (NPC), ampiamente utilizzate nella ricerca preclinica focalizzata sugli studi della sclerosi multipla. Per gli esperimenti in vitro, le NPs sono state marcate con un derivato fluorescente della PLGA, PLGA-rodaminaB, al fine di consentire il tracciamento cellulare, monitorare la localizzazione e distribuzione all’interno delle cellule, nonché valutare l’internalizzazione mediante tecniche specifiche di fluorescenza. Durante gli esperimenti cellulari, le NPs sono state incubate con le cellule per un periodo di tempo determinato. Successivamente, sono stati valutati la vitalità cellulare e la marcatura delle cellule al fine di comprendere possibili effetti causati dalle NPs sulle cellule staminali neurali. Quest’approccio mira a fornire informazioni dettagliate sulla capacità delle NPs di interagire con le cellule staminali umane e rappresenta un passo significativo nell'applicazione di queste NPs a fini di tracciamento cellulare in contesti di ricerca specifici come quelli legati alla sclerosi multipla. La vitalità cellulare è risultata eccellente, con variazioni minime rispetto al gruppo di controllo. La rilevazione delle cellule marcate è stata effettuata mediante citometria a flusso (FACS), mentre la quantità di atomi di fluoro incorporati è stata misurata mediante 19F-NMR, attestandosi maggiore per PLGA-NaC piuttosto che per PLGA-CS. Questi risultati evidenziano una promettente efficacia di assorbimento cellulare, in particolar modo per NaC-PLGA, sottolineando il potenziale di queste NPs per le applicazioni nel tracciamento cellulare mediante 19F-MRI. Al fine di comprendere dettagliatamente le dinamiche delle interazioni NP-cellule, è stato condotto uno studio specifico per visualizzare il posizionamento delle NPs all’interno delle cellule mediante l’impiego dell’immunofluorescenza. I risultati di tale analisi hanno indicato chiaramente una localizzazione citoplasmatica per entrambe le formulazioni. Inoltre, per confermare ulteriormente questi dati e rafforzare l’osservazione della maggiore efficienza di marcatura usando PLGA-NaC NPs rispetto a PLGA-CS NPs, è stato eseguito uno studio di RAMAN imaging. Quest’ultimo non ha solo confermato la maggiore efficienza di marcatura, ma ha anche consolidato l’osservazione della localizzazione citoplasmatica delle NPs all’interno delle cellule. Infine, uno studio di proliferazione è stato condotto con l'obiettivo di verificare che le NPs non influenzassero negativamente la proliferazione cellulare e valutare la capacità delle cellule di trattenere le nanoparticelle internalizzate nel lungo periodo (10 giorni). I risultati hanno indicato che le NPC incubate con le NPs non alterano in modo significativo il tasso di proliferazione, suggerendo che le NPs non compromettono la crescita cellulare. Inoltre, è stato osservato un significativo decremento dell'intensità media della fluorescenza (MFI) nel periodo prolungato rispetto alle prime 24 ore, suggerendo una notevole perdita di NPs da parte delle cellule. Tuttavia, nonostante ciò, le cellule conservano la capacità di trattenere un certo quantitativo di nanoparticelle anche dopo un periodo esteso di 10 giorni. Date le promettenti evidenze emerse dagli studi in vitro condotti sulle NPC umane, è stato considerato essenziale estendere la ricerca includendo anche studi in vitro su cellule staminali murine, in particolare NPC murine. L’espansione della ricerca a NPC murine mira a fornire una valutazione più completa e rappresentativa dell’interazione tra le nanoparticelle e le suddette cellule. Tale approccio è cruciale per una possibile futura applicazione di queste nanoparticelle in studi preclinici in vivo in modelli murini,, considerando la validità e la rilevanza dei risultati ottenuti nella ricerca preclinica. Di conseguenza, al fine di approfondire la comprensione delle interazioni tra le NPs e le NPC murine, sono stati condotti degli studi preliminari. Entrambe le formulazioni sono state sottoposte a un processo di incubazione con le suddette cellule, dopo il quale sono state ripetutamente esaminate la vitalità, la marcatura delle cellule e le interazioni biologiche. I risultati ottenuti hanno confermato la preservazione di un’eccellente vitalità cellulare con entrambe le formulazioni e la presenza di una maggiore corona proteica nelle PLGA-NaC rispetto a PLGA-CS. La marcatura cellulare, sebbene comparabile tra le due formulazioni, richiede ulteriori approfondimenti attraverso studi supplementari al fine di ottenere una comprensione completa delle dinamiche di interazione. L'obiettivo primario di questo lavoro è determinare quale delle due formulazioni dimostri una maggiore efficacia nel garantire una marcatura cellulare più elevata sulle cellule staminali umane e murine, contribuendo così a consolidare la scelta della formulazione ottimale per applicazioni future e ricerche precliniche in vivo. Questa fase preliminare costituisce una solida base per futuri approfondimenti e ricerche mirate. Tra le prossime fasi di studio, si prevede di completare gli esperimenti sulle cellule murine con ulteriori indagini sulla proliferazione cellulare e l’analisi dell’immunofluorescenza. Inoltre, verrà condotto uno studio di proteomica per identificare le proteine coinvolte nella formazione della corona proteica, fornendo così importanti dettagli riguardo l’internalizzazione delle NPs da parte di entrambi i tipi cellulari. Sono in programma anche studi in vivo per verificare il tracking cellulare nell’animale e si valuterà la formulazione di NPs in grado di veicolare un farmaco per il trattamento della sclerosi multipla. Questi approcci integrati contribuiranno a un approfondimento significativo delle conoscenze e potranno aprire nuove prospettive per applicazioni biomediche future.