Synthesis and characterisation of dual-drug loaded PLGA nanoparticles for the treatment of metastatic melanoma

Metastatic melanoma treatment has undergone several improvements in recent times, especially for what concerns the efficacy of the various, available therapies: immunotherapy allowed to achieve better melanoma prognosis, but this does not work as a resolutive cure yet, especially for what concerns metastatic forms of melanoma. In this regard, a recent research work from Dr. Luisa Lanfrancone’s group at the European Institute of Oncology (IEO) demonstrated how the combined administration of multiple chemotherapeutic drugs – such as Trametinib and Alisertib – leads to a drastic reduction in tumour growth and to an increase in average survival rate of mice treated in vivo. However, chemotherapy has intrinsic limitations related to the cytotoxicity of the employed agents, which is even enhanced whenever two or more of them are administered together. In this regard, nanomedicine can significantly support chemotherapy: in particular, it is known that the use of nanoparticles (NPs) as delivery vectors for antitumoral drugs can provide several improvements, especially for what concerns selective targeting of tumour sites and the reduction of side effects. This work positions in the field of nanomedicine and it is focused on the production of biodegradable polylactic-co-glycolic acid (PLGA) NPs for the combined encapsulation of Trametinib and Alisertib. The NPs were obtained by nanoprecipitation method and were characterized in terms of size and size dispersity. Colloidal stability in physiological conditions and protein corona formation in biological media were evaluated. NPs were aged at 37°C in specific culture media (IMDM and RPMI) that had been in contact with metastatic melanoma cell cultures. Experiments were done in the same conditions as the in vitro experiments with the NPs (3 days). The NPs were then isolated from the excess of proteins and analysed by Dynamic Light Scattering. Results showed that protein corona formation did not significantly affect either their average size – showing fluctuations by 20% – or NP size distribution, suggesting no formation of aggregates. For the qualitative analysis of the protein corona, isolated NPs by ultracentrifugation cycles after 4 h and 24 h incubation were analysed by SDS-PAGE. The results showed the presence of a limited protein corona, demonstrating that PVA stabilized the NPs (no aggregation) but does not fully prevent protein adsorption. These NPs were considered suitable for in vitro and in vivo tests. The next step was drug loading, and three different NPs were prepared: NPs containing single drugs (Trametinib or Alisertib) and dual-loaded NPs. Those NPs were analysed for what concerns their chemical-physical properties, showing that their average size and size distribution remained unaltered if compared with empty PLGA NPs. To evaluate the amount of Trametinib and Alisertib in a co-loaded NPs formulation, a matrix system made of two Beer-Lambert equations, evaluated at different wavelengths, was built: results showed that the Alisertib-to-Trametinib 5:1 molar ratio was kept constant upon NPs formulation, making them feasible to assess the therapeutic efficacy in vitro. Those tests demonstrated an enhancement in efficacy of Trametinib-loaded and co-loaded NPs with respect to the administration of free drugs. In particular, a reduction in IC50 value by 85% could be detected in both cases. On the other hand, in vivo tests concerning Trametinib-loaded NPs were conducted: as expected, an increase of therapeutic efficacy – if compared with the free drug administration – could be seen, both in terms of control of tumour volume growth and for what regards the average survival rate of the treated mice. Consequently, future developments in in vivo tests may concern the use of co-loaded NPs to assess any enhancement in therapeutic efficacy.

Il trattamento del melanoma metastatico ha visto diversi miglioramenti nel corso degli anni, specialmente per quanto riguarda l’efficacia delle singole terapie: l’immunoterapia ha permesso di ottenere una migliore prognosi del melanoma, ma ciò non rappresenta ancora una cura risolutiva, specialmente per quanto riguarda le forme metastatiche. In tal senso, un recente lavoro del gruppo di ricerca della dottoressa Luisa Lanfrancone dell’Istituto Europeo di Oncologia (IEO) ha mostrato come la somministrazione combinata di diversi farmaci chemioterapeutici – come Trametinib e Alisertib – porti a una riduzione drastica della crescita dei tumori e a un aumento della vita media dei topi trattati in vivo. Tuttavia, la chemioterapia ha diverse limitazioni intrinseche legate alla citotossicità degli agenti impiegati, che viene ulteriormente incrementata qualora due o più di essi vengano somministrati insieme. In questo senso, la nanomedicina può significativamente supportare la chemioterapia: in particolare, è noto come l’utilizzo di nanoparticelle (NP) come vettori di trasporto per farmaci antitumorali porti a diverse migliorie, specialmente per quanto riguarda il targeting selettivo dei siti tumorali e la riduzione degli effetti collaterali. Questo lavoro si colloca nell’ambito della nanomedicina ed è focalizzato sulla produzione di NP di acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA) per l’incapsulamento combinato di Trametinib e Alisertib. Le NP sono state ottenute con un metodo di nanoprecipitazione, e sono state caratterizzate in termini di dimensioni e distribuzione dimensionale. La stabilità colloidale in condizioni fisiologiche e la formazione di protein corona in mezzi fisiologici sono state poi valutate. Le NP sono state incubate a 37°C in specifici mezzi di coltura cellulare (IMDM e RPMI) che sono stati a contatto con colture cellulari di melanoma metastatico. Gli esperimenti sono stati compiuti nelle stesse condizioni degli esperimenti in vitro con le NP (3 giorni di durata). Dopodiché, le NP sono state isolate dall’eccesso di proteine e analizzare mediante Dynamic Light Scattering. I risultati mostrano come la formazione della protein corona non influenza significativamente né la dimensione – che mostra fluttuazioni nell’ordine del 20% – né la distribuzione di dimensioni delle NP, suggerendo che non si ha la formazione di aggregati. Per le analisi qualitative della protein corona, le NP isolate, mediante cicli di ultracentrifugazione, dopo 4 e 24 ore di incubazione sono state analizzare mediante SDS-PAGE. I risultati mostrano la presenza di una protein corona ridotta, dimostrando che la PVA stabilizza le NP (non si ha aggregazione), ma non previene totalmente l’adsorbimento delle proteine. Queste NP sono state considerate adeguate per i test in vitro e in vivo. Il passo successivo è il caricamento coi farmaci, e tre diverse NP sono state preparate: NP contenenti farmaci singoli (Trametinib o Alisertib) e NP caricate con ambedue i farmaci. Queste NP sono state analizzate per quanto concerne le loro proprietà chimico-fisiche, mostrando come la loro dimensione media e la distribuzione delle loro dimensioni rimanga inalterata se confrontate con NP di PLGA vuote. Per valutare il quantitativo di Trametinib e Alisertib in una formulazione di NP co-caricate, è stato realizzato un sistema di matrici, costituito da due equazioni di Lambert-Beer, valutate a diverse lunghezze d’onda: i risultati mostrano come il rapporto molare 5:1 tra Alisertib e Trametinib si mantenga costante anche dopo la formulazione di NP, rendendole utilizzabili per la determinazione della loro efficacia terapeutica in vitro. Questi test hanno dimostrato un aumento nell’efficacia delle NP caricate sia con Trametinib che con entrambi i farmaci, se confrontate con la somministrazione dei farmaci liberi. In particolare, si è potuta osservare una riduzione del valore di IC50 dell’85% in entrambi i casi. Dall’altro lato, sono stati condotti dei test in vivo concernenti NP caricate con Trametinib: come previsto, si è potuto riscontrare un aumento dell’efficacia terapeutica – se confrontata con la somministrazione di farmaci liberi – sia per quanto riguarda il controllo della crescita del volume del tumore, sia per quanto concerne il tasso di sopravvivenza media dei topi trattati. Di conseguenza, sviluppi futuri dei test in vivo possono riguardare l’utilizzo di NP co-caricate per valutarne le migliorie nell’efficacia terapeutica.