Investigation of living cell membrane density through Forster resonance energy transfer

Biological membranes are composed of phospholipids and proteins, and form barriers within living cells and organelles. These membranes, with integral and peripheral proteins, regulate cellular compartments and functions such as ion transport, signaling, and organelle structure maintenance. However, studying integral membrane proteins is challenging due to their hydrophobic nature, limiting their representation in structural databases. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) offers qualitative insights into chromophore proximity, making it valuable for studying phenomena like lipid exchange, membrane fusion, and lateral distribution. Förster resonance energy transfer (FRET) is a fundamental process where a fluorophore in an excited state transfers energy to a nearby molecule, based on overlap between their spectra. This interaction occurs over distances of 1 to 10 nm and is crucially dependent on factors like spectral overlap and spatial arrangement. FRET's efficiency reflects the fraction of absorbed photons effectively transferred to the acceptor, enabling precise measurement of molecular distances. It is widely used in studying molecular interactions and dynamics due to its noninvasive nature and high sensitivity, with applications including DNA studies, membrane, and protein analysis. Additionally, the photoluminescence lifetime is an intrinsic characteristic of a luminescent species that provides insights into its excited state dynamics. Time-Resolved Photoluminescence (TRPL) is a tool for studying fast electronic deactivation processes resulting in fluorescence emission. The lifetime of a molecule in its lowest excited singlet state typically ranges from picoseconds to nanoseconds and is influenced by factors such as molecular environment and interactions with other molecules. Processes like FRET, quenching, solvation dynamics, or molecular rotation affect the decay kinetics, providing information about the local chemical environment or reaction mechanisms. In this research, we investigate the dynamics of cellular membranes in Human embryonic kidney 293 cells (HEK 293) cells by using FRET and Time-Resolved Photoluminescence (TRPL) techniques. The membrane proteins of HEK cells were labeled with green and deep red cell masks, serving as donor and acceptor fluorophores respectively, to facilitate FRET analysis. To modulate the distances between membrane proteins and observe their effects on FRET efficiency, Photoluminescence (PL) intensity, and lifetime, we employed a novel approach of swelling the cells to enlarge the membrane. This allowed for controlled alterations in membrane size, subsequently influencing the spatial arrangement of membrane proteins. Both theoretically and experimentally, we examined the impact of these changes on FRET parameters. The results reveal the intricate molecular interactions governing cellular behavior and signaling pathways, providing insights into the structural and functional aspects of cellular membranes. This comprehensive approach enhances our understanding of cellular dynamics and contributes to the advancement of biological research.

Il trasferimento di energia per risonanza di Förster (FRET) è un processo fondamentale in cui un fluoroforo in stato eccitato trasferisce energia a una molecola vicina. Questa interazione avviene su distanze di 1-10 nm e dipendente da due fattori: la sovrapposizione spettrale e l'arrangiamento spaziale. L'efficienza del FRET misura la frazione di fotoni assorbiti dal donatore che sono trasferiti all'accettore. La misura del FRET permette di stimare, conoscendo le caratteristiche dei componenti, la loro mutua distanza su scala nanometrica. È ampiamente utilizzato nello studio delle interazioni molecolari e della dinamica grazie alla sua natura non invasiva e alla sua elevata sensibilità, con applicazioni che includono studi sul DNA, analisi di membrane e proteine. Inoltre, il tempo di vita della fotoluminescenza è una caratteristica intrinseca di una specie luminescente che fornisce informazioni sulla dinamica del suo stato eccitato. La fotoluminescenza a risoluzione temporale (TRPL) è uno strumento per lo studio dei processi di disattivazione elettronica veloce che comportano l'emissione di fluorescenza. Il tempo di vita di una molecola nel suo stato eccitato singoletto più basso varia tipicamente da picosecondi a nanosecondi ed è influenzato da fattori come l'ambiente molecolare e le interazioni con altre molecole. Processi come il FRET, il quenching, la dinamica di solvatazione o la rotazione molecolare influenzano la cinetica di decadimento, fornendo informazioni sull'ambiente chimico locale o sui meccanismi di reazione. Le membrane biologiche, composte da fosfolipidi e proteine, formano barriere che definiscono le cellule viventi e gli organelli intracellulari. Queste membrane, con proteine integrali e periferiche, regolano i compartimenti e le funzioni cellulari come il trasporto ionico, la segnalazione e il mantenimento della struttura dell'organello. Lo studio in-vivo delle proteine integrali di membrana è difficile a causa delle loro dimensioni e della loro delicatezza. Il FRET offre approfondimenti qualitativi sulla struttura, rendendolo prezioso per lo studio di fenomeni come lo scambio lipidico, la fusione di membrane e la diffusione laterale. In questa ricerca, indaghiamo la dinamica delle membrane cellulari nelle cellule HEK 293 utilizzando le tecniche FRET e TRPL. Le proteine di membrana delle cellule HEK sono state sensitizzate con coloranti cellulari verde e rosso scuro, che fungono da fluorofori donatori ed accettori rispettivamente, per facilitare l'analisi FRET. Per modulare le distanze tra le proteine di membrana e osservare i loro effetti sull'efficienza del FRET, sull'intensità della fotoluminescenza e sul tempo di vita. Per studiare l’effetto della distanza intermolecolare abbiamo impiegato un approccio innovativo che consiste nel gonfiaggio delle cellule. Ciò ha consentito alterazioni controllate delle dimensioni della membrana, influenzando successivamente l'arrangiamento spaziale delle proteine di membrana. Sia teoricamente che sperimentalmente, abbiamo esaminato l'impatto di questi cambiamenti sui parametri del FRET. I risultati rivelano le complesse interazioni molecolari che governano il comportamento cellulare e le loro vie di segnalazione, fornendo approfondimenti sugli aspetti strutturali e funzionali delle membrane cellulari. Questo studio approfondisce la nostra comprensione della dinamica cellulare e contribuisce all'avanzamento delle conoscenze in biologia cellulare.