Tunnel widening by enzyme engineering of a deglycating enzyme to improve diabetic enzymatic assays.

Fructosyl Peptide Oxidases (FPOX) are deglycation enzymes used as key enzymatic components in diabetes monitoring devices. At present, FPOX used in enzymatic assays is not able to directly detect whole glycated proteins. This requires to perform a preliminary proteolytic treatment of the target protein to generate small glycated peptides that can act as viable substrates for the enzyme. This is an expensive and time-consuming step. In this work, we applied a Rational Design approach to an already modified FPOX to further widen the access tunnel leading to the active site of the enzyme, thus improving its catalytic activity towards large substrates. We identified a potentially expendable loop that limits the access to the active site. Using Rosetta Remodel we shortened the loop (from 8 amino acids to 2-5 amino acids) generating a library of 2064 enzyme variants. We then performed molecular dynamics simulations at 300K, 350K and 400K to assess their stability. Our approach allowed the selection of 5 mutants, which have been successfully expressed and showed greater activity toward glycated residues. This may represent a significant step towards the development of in vitro HbA1c diagnostic devices based on a direct enzymatic oxidation system.

Le Fructosyl Peptide Oxidase (FPOX) sono enzimi di deglicazione utilizzati come componenti enzimatici chiave nei dispositivi di monitoraggio del diabete. Attualmente, le FPOX utilizzate nei test enzimatici non sono in grado di rilevare direttamente le proteine glicate intere. È necessario eseguire un trattamento proteolitico preliminare della proteina di riferimento per generare piccoli peptidi glicati che possano fungere da substrati validi per l’enzima. Si tratta di una fase costosa e lunga. In questo lavoro, abbiamo applicato un approccio di Rational Design a un FPOX già modificato per ampliare ulteriormente il tunnel di accesso al sito attivo dell’enzima, migliorando così la sua attività catalitica verso grandi substrati. Abbiamo identificato un loop potenzialmente sacrificabile che limita l’accesso al sito attivo. Utilizzando Rosetta Remodel abbiamo accorciato il loop (da 8 aminoacidi a 2-5 aminoacidi) generando una libreria di 2064 varianti dell’enzima. Abbiamo quindi eseguito simulazioni di dinamica molecolare a 300K, 350K e 400K per valutarne la stabilità. Il nostro approccio ha permesso di selezionare 5 mutanti, che sono stati espressi con successo e hanno mostrato una maggiore attività verso i residui glicati. Questo può rappresentare un passo significativo verso lo sviluppo di dispositivi diagnostici in vitro per HbA1c basati su un sistema di ossidazione enzimatica diretta.