From the endothelium to the gut vascular barrier: towards a three-compartmental device for in vitro modelling of intestinal barrier

The Thesis aims to develop an in vitro model of gut vascular barrier (GVB) under static conditions in TToP (True Tissue on Platform), a dual chamber micro-physiological platform, capable of hosting microporous polymeric membranes or 3D structures, developed at μBSLab and ATTiC Lab of Politecnico di Milano. An incremental approach was adopted, starting with an in vitro model of endothelium using EA.hy926 cell line. Preliminary tests were conducted to evaluate the behavior of these cells on a standard polycarbonate microporous membrane. Following this, various substrates were compared through TEER measurements and immunostaining analyses to identify the most promising one in terms of cells proliferation and maturation. Moreover, the study aimed to investigate the endothelial cells response to chemoattractants: to achieve this, the chemotaxis assay was carried out on TToP device. The research moved on to a co-culture model by integrating the endothelial cell line EA.hy926 with the epithelial cell line Caco-2. Initially, a co-culture protocol was developed with one cell type seeded on the upper side of the membrane and the other on the lower side of the membrane of the bicompartmental device. Preliminary tests were then conducted on Caco-2 cells to assess whether TEER values remained consistent irrespective of their positioning on the membrane. Based on the obtained results, two co-culture models were implemented: the first model was PC-membrane based and aimed at evaluating the influence of EA.hy926 on the Caco-2 monolayer, while the second used gelatin and silk-fibroin scaffolds to study their impact on cells behavior. The complexity of the model was further elevated to a three-compartmental configuration, taking inspiration from TToP bicompartmental model. The device was adapted to accommodate two membranes suitable for cell seeding, with a hydrogel inserted between them to recreate a three-dimensional structure and three different but interconnecting compartments. This setup enabled a more reliable mimicry of the multilayered structure of the GVB. The development process included defining design requirements, prototyping and conducting a technical validation followed by a preliminary biological validation to verify the viability of the seeded cells within the device. From the results it was observed that substrates different from PC membrane were able to offer a more conducive environment for cell maturation and proliferation, both in the endothelium and co-culture models. Furthermore, the response to a chemical stimulus was assessed for EA.hy926 cells through chemotaxis assay. Moving on to the threecompartmental device, technical validation led to the identification of the optimal prototype which demonstrated an hydraulic tightness and compartmentalization comparable with the traditional TToP. Moreover, due to the fact that preliminary biological validation for the three-compartmental system led to promising results, further tests must be conducted to thoroughly characterize the device and maximize its potential.

La seguente Tesi si propone di sviluppare un modello in vitro di barriera vascolare intestinale (GVB) in condizioni statiche su TToP (True Tissue on Platform), una piattaforma microfisiologica a bicompartimentale, in grado di ospitare membrane polimeriche microporose o strutture 3D, sviluppata presso il μBSLab e l’ATTiC Lab del Politecnico di Milano. È stato adottato un approccio incrementale, partendo dallo sviluppo di un modello in vitro di endotelio usando la linea cellulare EA.hy926. Sono stati condotti test preliminari per valutare il comportamento di queste cellule su una membrana microporosa standard in policarbonato. In seguito, sono stati confrontati diversi substrati attraverso misurazioni TEER e immunofluorescenza per identificare quello più promettente in termini di proliferazione e maturazione cellulare. Inoltre, è stata valutata la risposta delle cellule endoteliali agli agenti chemioattrattori: a tal fine, il saggio di chemiotassi è stato condotto sul dispositivo TToP. Successivamente lo studio si è spostato su un modello di co-cultura integrando la linea endoteliale EA.hy926 con la linea epiteliale Caco-2. Inizialmente, è stato sviluppato un protocollo di co-cultura che ha previsto la semina di un tipo cellulare sul lato superiore della membrana e l’altro tipo cellulare sul lato inferiore della membrana del dispositivo bicompartimentale. Sono stati quindi condotti test preliminari sulle Caco-2 per valutare se i valori di TEER rimanessero coerenti indipendentemente dal loro posizionamento sulla membrana. Sulla base dei risultati ottenuti, sono stati implementati due modelli di co-coltura: il primo modello, basato su membrana in policarbonato, mirava a valutare l’influenza delle EA.hy926 sul monostrato di Caco-2. Il secondo modello di co-coltura ha compreso l’utilizzo di scaffold in gelatina e in fibroina della seta per studiare il loro impatto sul comportamento delle cellule. Il progetto si conclude con la realizzazione di un sistema tricompartimentale, ispirato al modello di TToP standard bicompartimentale. Il dispositivo è stato riadattato per ospitare due membrane idonee alla semina cellulare, con un gel inserito tra di esse per ricreare una struttura tridimensionale con tre compartimenti diversi ma interconnessi. Questa configurazione ha permesso di replicare in modo più affidabile la struttura multistrato della GVB. Sono stati quindi definiti i requisiti di progetto, è stata eseguita la prototipazione, la validazione tecnica e infine una validazione biologica preliminare per studiare la vitalità cellulare all’interno del dispositivo. Dai risultati è stato osservato che substrati differenti dalla membrana in policarbonato erano in grado di offrire un ambiente più favorevole alla maturazione e alla proliferazione delle cellule, sia nel modello di endotelio che nella co-coltura. Inoltre, è stata verificata la risposta delle EA.hy926 ad uno stimolo chemioattrattivo attraverso il saggio di chemiotassi. Passando al dispositivo tricompartimentale, la validazione tecnica ha portato all’identificazione del prototipo ottimale il quale ha dimostrato tenuta idraulica e compartimentalizzazione confrontabili con il TToP standard. Inoltre, dato che la validazione biologica preliminare del sistema tricompartimentale ha portato a risultati promettenti, è necessario eseguire ulteriori test per caratterizzare a fondo il dispositivo e massimizzarne il potenziale.