Study on the optimisation of FJD2N-mediated transfection of NIH3T3 cells and on the potential role of SAWs as transfection adjuvants.

Eukaryotic cell transfection is a key technique in molecular biology and biotechnology involving the delivery of foreign genetic material. It revolutionized the study of gene function and protein expression, showing promise in treating incurable and inherited genetic diseases. However, genetic material is prone to degradation by cellular nucleases, requiring complexation with suitable transfection reagents for protection and efficient delivery. In this work, the efficiency of the protonable Fluorinated Janus-type Dendrimer of 2nd generation (FJD2N) as a novel transfection reagent was investigated, and its transfection protocol for the delivery of PXN-pEGFP plasmid to NIH3T3 cells was ultimately optimised. FJD2N represents an innovative theranostic system combining gene-based therapies with 19F-MRI traceability. FJD2N cytocompatibility and transfection efficiency proved to be comparable to those of commercially available polymer-based transfection reagents (JetPRIME®). This work also entailed the production and optimisation of surface acoustic waves (SAWs) devices and the study of the beneficial US-SAWs effects on transfection processes and cell manipulation. After the transfection protocols optimisation, said SAW-devices were tested on NIH3T3 cells with the aim of further improving gene delivery efficiences. In fact, SAWs role in the biomedical field has been extensively investigated in the last decades, and recent studies suggest that they may prove valuable transfection adjuvants by inducing a temporary fluidisation of the cells cytoskeleton and destabilisation of the cell membrane, increasing the cell uptake of nanoparticles upon transfection. Preliminary experiments conducted on JetPRIME®-transfected NIH3T3 cells treated with 1MHz SAWs yielded a modest yet noticeable increase in the amount of successfully transfected cells, suggesting that an optimised SAW-treatment might represent a valuable support to pDNA transfections.

La trasfezione è una tecnica chiave nella biologia molecolare che coinvolge la veicolazione di materiale genetico estraneo alle cellule eucariotiche. Tale tecnica ha rivoluzionato lo studio della funzione genica e dell'espressione proteica, mostrandosi promettente nel trattamento di malattie genetiche incurabili ed ereditarie. Tuttavia, il materiale genetico è soggetto a degradazione da parte delle nucleasi cellulari, richiedendo la complessazione con opportuni agenti di trasfezione per un delivery efficiente. Questa tesi investiga l'efficienza del dendrimero Janus-type di seconda generazione fluorurato protonabile FJD2N come nuovo agente di trasfezione, e propone un protocollo ottimizzato per la veicolazione del plasmide PXN-pEGFP a cellule NIH3T3. FJD2N rappresenta un sistema teranostico innovativo che combina la terapia genica alla tracciabilità tramite 19F-MRI, la cui citocompatibilità ed efficienza di trasfezione si sono dimostrate comparabili a quelle dei reagenti polimerici disponibili sul mercato (JetPRIME®). Questo lavoro comprende anche la produzione di dispositivi a onde acustiche superficiali (SAW) e lo studio degli effetti benefici delle SAW sui processi di trasfezione e manipolazione cellulare. Dopo l'ottimizzazione dei protocolli di trasfezione, i dispositivi sono stati testati sulle cellule con l'obiettivo di migliorare ulteriormente l’efficienza di tale processo: recenti studi suggeriscono, infatti, che le SAW possano contribuire positivamente alla trasfezione inducendo una fluidizzazione temporanea del citoscheletro cellulare e instabilità nella membrana plasmatica, aumentando l’uptake delle nanoparticelle da parte della cellula. Esperimenti preliminari condotti sulle cellule NIH3T3 trasfettate con JetPRIME® trattate con SAW a 1 MHz hanno prodotto un aumento modesto ma evidente del numero di cellule trasfettate con successo, suggerendo che un trattamento SAW ottimizzato potrebbe rappresentare un valido supporto alle trasfezioni di pDNA.