On-chip tracking of human mesenchymal cells gene expression profile to unravel mechanically driven chondrogenesis processes

Embryo limbs chondrogenesis starts with the formation of a cartilage tissue template, which plays a crucial role in the subsequent development of mature skeletal structure. During limb bud development, progenitor cells, such as Mesenchymal Stromal Cells (MSCs), experience a variety of mechanical stimuli which contributes to guide their fate and differentiation into mature chondrocytes. Despite powerful to mimic mechanical processes characterizing limb bud development, recently introduced mechanically active Organ-on-Chip models still lack real-time analysis capabilities and are therefore limited in dissecting the time course of mechanically driven cell fate regulation. To fill this gap, the present study aims at obtaining preliminary results to develop a strategy for real-time on-chip monitoring of the gene profile of human MSCs once exposed to a mechanically active environment. Towards this aim, a method to transfect human MSCs with non-viral vectors was optimized using fluorescent reporter genes, including plasmid DNA encoding for yellow fluorescent protein (pEYFP) and mRNA for red fluorescent protein (mCherry). First, transfection experiments were carried out in 2D MSCs cultures to set the optimal experimental conditions. Subsequently, on-chip transfection assays were performed, employing previously developed multilayered microfluidic platforms. Two different approaches were envisioned to transfect cells: i) 2D transfection and subsequent cell injection in the device after 24h (i.e., indirect on-chip transfection); ii) 3D transfection cells-laden fibrin gel directly within the microfluidic platform (i.e., direct on-chip transfection). To evaluate transfection efficiency, fluorescence microscopy analysis was employed to detect the encoded fluorescent proteins during a 7 days’ time course. In conclusion, both strategies led to a high transfection efficiency. This study opens the path to real-time monitoring of reporter genes (e.g., SOX9, RunX2) whose expression is involved in the mechanically driven differentiation process of mesenchymal stem cells into mature chondrocytes.

La condrogenesi è il processo di differenziamento delle cellule staminali mesenchimali (MSCs) in condrociti maturi con conseguente formazione del tessuto cartilagineo, il quale svolge un ruolo cruciale nel successivo sviluppo della struttura scheletrica. Durante lo sviluppo embrionale degli arti, le cellule progenitrici sperimentano una varietà di stimoli meccanici che contribuiscono a guidarne il destino e la differenziazione in condrociti maturi. I modelli Organ-on-Chip meccanicamente attivi introdotti di recente, mancano ancora di capacità di analisi in tempo reale e sono quindi limitati nella regolazione del destino cellulare. Per colmare questa lacuna, il presente studio mira a ottenere risultati preliminari per sviluppare una strategia per il monitoraggio in tempo reale su chip del profilo genico delle MSCs umane, una volta esposte a un ambiente meccanicamente attivo. A tale scopo, è stato ottimizzato un metodo di trasfezione delle cellule primarie con vettori non virali utilizzando geni reporter fluorescenti, tra cui il DNA plasmidico che codifica per la proteina fluorescente gialla (pEYFP) e l'mRNA per la proteina fluorescente rossa (mCherry). In primo luogo, sono stati condotti esperimenti di trasfezione in colture 2D per stabilire le condizioni sperimentali ottimali. Successivamente, sono stati eseguiti protocolli di trasfezione su chip, utilizzando piattaforme microfluidiche precedentemente sviluppate. Per la trasfezione delle cellule sono stati previsti due approcci diversi: i) trasfezione 2D e successiva iniezione delle cellule nel dispositivo dopo 24 ore (i.e., trasfezione indiretta su chip); ii) trasfezione 3D con gel di fibrina caricato di cellule direttamente all'interno della piattaforma microfluidica (i.e., trasfezione diretta su chip). Per valutare l'efficienza della trasfezione, è stata utilizzata la microscopia a fluorescenza per tracciare l’espressione delle proteine fluorescenti durante un periodo di 7 giorni. In conclusione, dai risultati di entrambe le strategie si è osservata una buona efficienza di trasfezione. Questo studio apre la strada al monitoraggio in tempo reale dell'espressione dei geni reporter coinvolti nel processo di differenziazione meccanicamente guidato delle cellule staminali mesenchimali in condrociti maturi (ad esempio, SOX9, RunX2).