Engineered cationic polymers for intracellular delivery of therapeutic proteins

Protein-based therapeutics have gained significant attention over the past decades for the treatment of various pathologies, including infectious diseases, genetic disorders, and cancer. To exploit their full potential, most proteins need to be directly delivered in the cytosol, since many targets are located inside the cell. For this reason, intracellular delivery of therapeutic agents becomes a fundamental issue to the development of successful and effective treatments. Current delivery techniques include physical methods, protein chemical modification and the use of nanocarriers. Among these various approaches, protein conjugation with synthetic cationic polymers stands out as a promising strategy to deliver the active form of the protein inside the cell, overcoming most hurdles associated with intracellular delivery, such as the plasma membrane barrier or endosomal entrapment. This master thesis work aims at obtaining protein-polymer conjugates for intracellular delivery through a “grafting to” approach. First, poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate] (PDMAEMA) homopolymers were synthesized via Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) to create a wide range of molecular weights for the subsequent conjugation. Then, fluorescent monomers and glycidyl methacrylate were inserted in the main polymeric chain to create traceable copolymers with functional groups for further modification. Afterwards, protein-polymer conjugates were obtained exploiting click chemistry techniques, in particular Copper(I)-catalysed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). Initially, the reaction conditions were tested on azide-modified Bovine Serum Albumin (BSA) before moving to Superoxide Dismutase (SOD), a therapeutic protein for treating oxidative stress in cells. The results of the conjugation reactions were assessed through electrophoresis. Outcomes were satisfactory for both polymerization and conjugation reactions, resulting in engineered nanosystems with potential application for intracellular delivery.

Le terapie a base di proteine hanno ottenuto notevole attenzione negli ultimi decenni per il trattamento di varie patologie, tra cui malattie infettive, disturbi genetici e il cancro. Per sfruttare maggiormente il potenziale delle proteine, la maggior parte di esse deve essere introdotta direttamente nel citosol, poiché molti bersagli si trovano all'interno della cellula. Per questo motivo, il trasporto intracellulare di agenti terapeutici è fondamentale per lo sviluppo di terapie efficaci. Le attuali tecniche di trasporto intracellulare comprendono metodi fisici, modifiche della proteina a livello chimico e l'uso di nanoveicoli. Tra questi vari approcci, il legame covalente di proteine con polimeri cationici sintetici rappresenta una strategia promettente per introdurre nella cellula la forma attiva della proteina, superando gran parte degli ostacoli associati al trasporto intracellulare, come la barriera determinata dalla membrana plasmatica o l'intrappolamento all’interno degli endosomi. Questo progetto di tesi magistrale mira a ottenere sistemi proteina-polimero per il trasporto intracellulare attraverso un approccio di "grafting to". Inizialmente, sono stati sintetizzati omopolimeri di poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate] (PDMAEMA) mediante la tecnica di polimerizzazione radicalica a trasferimento atomico (ATRP), in modo da creare una vasta gamma di pesi molecolari per la successiva reazione di coniugazione. Dopodiché, monomeri fluorescenti e unità di glycidyl methacrylate sono stati inseriti nella catena polimerica, con l’obiettivo di formare copolimeri tracciabili e contenenti gruppi funzionali per permettere ulteriori modifiche. In seguito, i coniugati proteina-polimero sono stati sintetizzati sfruttando tecniche di click chemistry, in particolare la cicloaddizione azide-alchino catalizzata dal rame(I) (CuAAC). Inizialmente, le condizioni di reazione sono state testate su Albumina Sierica Bovina (BSA) modificata con azide prima di passare alla Superossido Dismutasi (SOD), una proteina terapeutica per il trattamento dello stress ossidativo nelle cellule. Gli esiti delle reazioni di coniugazione sono stati valutati attraverso elettroforesi su gel di poliacrilamide. I risultati sono stati soddisfacenti sia per le reazioni di polimerizzazione che per quelle di coniugazione, ottenendo nanosistemi ingegnerizzati per potenziali applicazioni di trasporto intracellulare.