Microfabbricazione di substrati in PDMS a rigidezza variabile per modelli cellulari in vitro

In recent years, engineered substrates with varying stiffnesses have been developed for studying cellular mechanobiology and replicating the cellular microenvironment in vitro under both physiological and pathological conditions. The use of substrates composed of three-dimensional microstructures, with variations in structural stiffness, allows for simulating and observing cellular responses in different contexts. Polydimethylsiloxane (PDMS, Dow Sylgard 184) has proven particularly suitable for fabricating these microstructures due to its advantageous mechanical and chemical properties, conducive to manufacturing and suitable for the stiffness conditions to be replicated. In this project, a microfabrication process has been optimized to obtain PDMS substrates with controlled dimensions and distribution of micropillars. These micropillars act as passive, flexible structures. Their stiffness can be modulated based on the pillar shape and material mechanical properties, enabling the simulation of various in vitro biological conditions. Starting from a reference study, silicon molds were produced to polymerize PDMS with three different dimensional ratios (1:1, 1:2, 1:3) using Reactive Ion Etching (RIE) technique. A thin layer of chromium was previously deposited on the silicon substrate to define a mask for RIE. Subsequently, the substrate underwent photolithography (Maskless Heidelberg MLA 100; AZ1505) using a software mask composed of circles with a diameter of 2 μm, spaced 4 μm center to center, arranged in a hexagonal configuration. Process optimization was achieved by following a standard protocol, combining and testing various photolithographic exposure and RIE etching parameters. Measurements of the cross-sectional areas of the holes on the mold were performed using SEM microscopy, obtaining holes with a diameter of 2.6 μm and etching depths of 2.6, 5.5, and 7.8 μm, from which PDMS pillars with heights of 2.6, 5.5, and 7.05 μm were fabricated. The stiffness of PDMS micropillars can be modulated through various parameters: dimensional ratio, Young's modulus of the material, which depends on the PDMS concentration ratio, temperature, and polymerization time. For PDMS preparation in this study, a mixing ratio of 10:1 between the base resin and curing agent was used, with polymerization at 80°C for 15 hours. (E=2MPa, literature value- Ghassemi 2012) For biological validation, three different samples with different stiffnesses were tested to simulate various biological conditions. Each sample was placed in a 96-well culture plate, coated with fibronectin (FN) to promote cell adhesion, and subsequently seeded with murine endothelial cells H5V. After incubation for 24 and 48 hours, phase-contrast and fluorescence images were acquired to examine cellular morphology. During the image acquisition phase for analyzing the experimental data obtained, some challenges emerged in image acquisition and measurement repeatability, which could be addressed by modifying the experimental setup and/or improving certain aspects of the fabrication protocol. Data collected from an experiment demonstrated statistically significant differences in cellular morphologies related to substrate stiffness (441kPa, h= 2.66 μm; 47.19 KPa, h= 5.5 μm), confirming the existence of a relationship between cellular morphology and substrate stiffness.

Negli ultimi anni, sono stati sviluppati substrati ingegnerizzati con diverse rigidezze per lo studio della meccanobiologia cellulare e replicare in vitro il microambiente cellulare sia in condizioni fisiologiche che patologiche. L'impiego di substrati costituiti da microstrutture tridimensionali, con variazioni nella rigidezza strutturale, permette di simulare e osservare le risposte cellulari in differenti contesti. Il polidimetilsilossano (PDMS, Dow Sylgard 184) si è dimostrato particolarmente adatto alla realizzazione di queste microstrutture per le sue proprietà meccaniche e chimiche, favorevoli per la fabbricazione e adatte alle condizioni di rigidezza da replicare. In questo progetto, è stato ottimizzato un processo di microfabbricazione per ottenere substrati in PDMS con micropilastri di dimensioni e distribuzione controllate. Questi micropilastri agiscono come strutture passive, flessibili. È possibile modulare la loro rigidezza in base alla forma del pilastro e alle proprietà meccaniche del materiale, permettendo di simulare diverse condizioni biologiche in vitro. Partendo da uno studio di riferimento, sono stati prodotti stampi in silicio, nei quali polimerizzare il PDMS, con tre differenti rapporti dimensionali (1:1, 1:2, 1:3) mediante l'applicazione della tecnica del Reactive Ion Etching (RIE). Sul substrato in silicio è stato precedentemente depositato uno strato sottile di cromo, utile alla definizione di una maschera per il RIE. Successivamente il substrato è stato sottoposto a fotolitografia (Maskless Heidelberg MLA 100; AZ1505) impiegando una maschera software composta da cerchi con un diametro di 2 μm, distanziati di 4 μm da centro a centro e disposti in configurazione esagonale. L'ottimizzazione dei processi è stata raggiunta seguendo un protocollo standard, combinando e testando diversi parametri di esposizione fotolitografica e di scavo al RIE. Le misurazioni delle sezioni trasversali dei fori sullo stampo sono state effettuate tramite microscopia SEM, ottenendo fori con un diametro di 2.6μm e profondità di scavo di 2.6, 5.5 e 7.8 μm, dai quali sono stati fabbricati i pilastri in PDMS con altezze di 2.6, 5.5 e 7.05 μm. La rigidezza dei micropilastri in PDMS può essere modulata attraverso diversi parametri: il rapporto dimensionale, il modulo di Young del materiale, che dipende dal rapporto di concentrazione del PDMS, la temperatura e il tempo di polimerizzazione. Per la preparazione del PDMS in questo studio, è stato utilizzato un rapporto di miscelazione di 10:1 tra la resina di base e l'agente indurente, con polimerizzazione a 80°C per 15 ore. (E=2MPa, valore di letteratura-Ghassemi 2012) Per la validazione biologica, sono stati testati tre diversi campioni con differenti rigidezze per simulare varie condizioni biologiche. Ciascun campione è stato collocato in una piastra di coltura da 96 pozzetti, rivestito con fibronectina (FN) per favorire l'adesione cellulare, e successivamente seminato con cellule endoteliali murine H5V. Dopo incubazione per 24 e 48 ore, sono state acquisite immagini in contrasto di fase e fluorescenza per esaminare la morfologia cellulare. Durante la fase di acquisizione dell’immagine per l’analisi dei dati sperimentali ottenuti, sono emerse alcune criticità nell’acquisizione delle immagini e nella ripetibilità delle misurazioni, difficoltà affrontabili modificando il setup sperimentale e/o migliorando alcuni aspetti del protocollo di fabbricazione. I dati raccolti da un esperimento hanno dimostrato differenze statisticamente significative nelle morfologie cellulari in relazione alla rigidezza dei substrati (441kPa, h= 2.66 μm; 47.19 KPa, h= 5.5 μm) confermando l’esistenza di una relazione tra la morfologia cellulare e la rigidezza del substrato.