Fluorinated systems for biomedical applications : from imaging to drug delivery

Fluorination represents a powerful tool to tailor the properties of organic molecules, and biomedical research gets big advantages from the resulting systems in the fields of bioimaging and drug delivery, which are both relevant to the present thesis. The multiple benefits provided by fluorine are mainly related to its unique properties, such as high electronegativity, hydrophobicity, low polarizability, small steric demand, and very good magnetic response. In particular, Magnetic Resonance Imaging (MRI) based on 19F provides an effective platform for diagnosis and selectively guided therapies. Due to the low amount of endogenous organic 19F atoms in the human body, this nucleus provides good contrast, and furnishes useful anatomical information, if coupled with 1H-MRI. However, fluorinated tracers have limited solubility in biological media. For this reason, proper formulations are a main target for their clinical use. In my thesis work, I focused on the study of amphiphilic fluorinated dendrimers that self-assemble in aqueous environments into supramolecular structures, e.g., micelles and vesicles, creating fluorophilic regions able to host fluorinated tracers. In this context, two synthesized amphiphilic dendrimers, BFTG2-OH and BFTG2-S, were demonstrated to efficiently host the popular 19F-MRI tracer PERFECTA, allowing its efficient dispersion in water. An optimized formulation via nanoprecipitation was developed, which led to more than 50% of solubilized PERFECTA. Preliminary 19F-MRI experiments on PERFECTA@BFTG2-OH and PERFECTA@BFTG2-S demonstrated the validity of the approach, producing bright images. In particular, BFTG2-S dendrimer was designed with the aim to confer selectivity for cells involved in the inflammatory response, and preliminary data confirmed the targetability of the system. Another strategy I exploited to disperse PERFECTA in biological solutions was the use of two natural proteins, i.e., bovine serum albumin (BSA) and lysozyme (LYS). PERFECTA@protein formulations were prepared, exploring different stoichiometry ratios, achieving a good loading of PERFECTA. An interesting structural transition observed in LYS upon interacting with PERFECTA prompted us to study in more detail the supramolecular chemistry behind the formation of PERFECTA@LYS complexes. A detailed structural characterization along with computational modelling highlighted the formation of unprecedented rod-like oligomers. Finally, fluorination was also demonstrated to have a key role in driving, enhancing, and modifying the self-assembly of N-Fmoc protected amino acids yielding hydrogels, which were used for drug delivery. In particular, I focused on N-Fmoc-pentafluorophenylalanine, an effective low molecular weight hydrogelator (LMWH), and tuned its properties by involving it in hydrogen-bonded co-crystals with biologically relevant molecules. Importantly, a supramolecular acid⋯amide synthon formation between the -COOH group of the gelator and the -CONH2 group of the drug-like molecule was exploited to drive their co-crystallization in a two-component system. Importantly, the co-crystal structure was demonstrated to survive in the gel state, where efficient Fmoc group packing was frustrated resulting in gel rheology weakening. Delayed release of the co-crystal former from the gel was demonstrated also when involving Vitamin B3 as a biologically relevant co-crystal former. Finally, the strategy to modify gelation properties of Fmoc-based LMWHs by interfering with the fibre packing of Fmoc groups was also demonstrated by using a halogen bond (XB)-donor hydrogelator, namely N-Fmoc-2,3,5,6-tetrafluoro-4-iodophenylalanine. Involvement of the XB-donor in interactions with solvents and salts resulted in weakening of the gel as a result of the perturbation of the Fmoc packing in the gel fibres, as demonstrated by solid-state X-ray structures.

La fluorurazione rappresenta uno strumento potente per modulare le proprietà delle molecole organiche, e la ricerca in ambito biomedico trae grandi vantaggi dai sistemi che ne derivano. In particolare, questi ultimi trovano applicazione nei campi del bioimaging e del rilascio di farmaci, entrambi rilevanti per questa tesi. I molteplici benefici offerti dal fluoro sono principalmente legati alle sue proprietà uniche, come l'alta elettronegatività, l'idrofobicità, la bassa polarizzabilità, la ridotta richiesta sterica e l’ottima risposta magnetica. In particolare, l'Imaging a Risonanza Magnetica (MRI) basato sul 19F fornisce un efficace strumento per la diagnostica e le terapie guidate. Grazie alla bassa quantità di atomi di 19F organico endogeno nel corpo umano, questo nucleo fornisce un buon contrasto e utili informazioni anatomiche, se accoppiato con 1H-MRI. Tuttavia, i traccianti fluorurati hanno una solubilità limitata nei mezzi biologici. Per questo motivo, il design di formulazioni adeguate sono un obiettivo principe per il loro uso clinico. Nel mio lavoro di tesi, mi sono concentrata sullo studio di dendrimeri fluorurati anfifilici che si auto-assemblano in ambiente acquoso in strutture supramolecolari, ad esempio micelle e vescicole, creando regioni fluorofiliche in grado di ospitare traccianti fluorurati. In questo contesto, i due dendrimeri anfifilici di sintesi BFTG2-OH e BFTG2-S hanno dimostrato di ospitare efficientemente PERFECTA, noto tracciante per 19F-MRI, consentendone l’efficiente dispersione in acqua. È stata sviluppata una formulazione ottimizzata tramite un metodo di nanoprecipitazione, la quale ha portato ad una quantità di PERFECTA solubilizzato oltre il 50%. Gli esperimenti preliminari di 19F-MRI su PERFECTA@BFTG2-OH e PERFECTA@BFTG2-S hanno dimostrato la validità dell'approccio, producendo intense risposte di risonanza magnetica. In aggiunta, il dendrimero BFTG2-S è stato progettato con l'obiettivo di conferire selettività verso cellule coinvolte nella risposta infiammatoria, e dati preliminari hanno confermato la capacità di targeting del sistema. Un ulteriore approccio utilizzato per la dispersione di PERFECTA in soluzioni biologiche ha coinvolto l'utilizzo di due proteine naturali, precisamente l'albumina sierica bovina (BSA) e il lisozima (LYS). Sono state preparate formulazioni PERFECTA@proteine, esplorando diversi rapporti stechiometrici e ottenendo un buon loading di PERFECTA. L'osservazione di una transizione strutturale significativa in LYS in seguito all'interazione con PERFECTA ha suscitato l'interesse a indagare più approfonditamente i meccanismi di chimica supramolecolare implicati nella formazione dei complessi PERFECTA@LYS. Una caratterizzazione strutturale dettagliata insieme alla modellazione computazionale hanno evidenziato la formazione di oligomeri a forma di rods senza precedenti. Infine, è stato dimostrato che la fluorurazione svolge un ruolo fondamentale nel dirigere, potenziare e modificare l'auto-assemblaggio degli amminoacidi N-Fmoc protetti promuovendo la formazione di idrogeli, che sono stati utilizzati per il rilascio di farmaci. In particolare, mi sono concentrata sulla N-Fmoc-pentafluorofenilalanina, un efficace idrogelatore a basso peso molecolare. Le sue proprietà sono state modulate attraverso il suo coinvolgimento in co-cristalli a legame idrogeno con molecole biologicamente rilevanti. Un elemento di rilievo è stato l'impiego della formazione del sintone supramolecolare acido⋯ammide tra il gruppo -COOH del gelatore e il gruppo -CONH2 della molecola partner, simil-farmaco, al fine di favorire la loro co-cristallizzazione in un sistema a due componenti. È essenziale evidenziare che la struttura del co-cristallo rimanga inalterata anche nello stato di gel. In conseguenza, l'efficace impacchettamento del gruppo Fmoc viene compromesso, portando a un indebolimento delle proprietà reologiche del gel bicomponente. Il rilascio ritardato del partner di cristallizzazione dal gel è stata dimostrata anche utilizzando la vitamina B3, rilevante biologicamente. Infine, la strategia cristallografica come punto di partenza per modificare le proprietà di gelificazione degli Fmoc-amminoacidi è stata dimostrata anche utilizzando un idrogelatore donatore di legame alogeno (XB), cioè N-Fmoc-2,3,5,6-tetrafluoro-4-iodofenilalanina. Il coinvolgimento del donatore-XB nelle interazioni con solventi e sali ha portato ad un indebolimento del gel a causa della perturbazione dell'impacchettamento del gruppo Fmoc nelle fibre del gel, come dimostrato dall’analisi a raggi-X delle strutture nello stato solido.