Design of Nanodiamonds-D-amino acid oxidase nanosystems for potential antitumor applications: in vitro evaluation of the biocompatibility, the cytotoxicity, and the induction of oxidative stress

Enzyme-activated prodrug therapy (EPT), a new frontier in the fight against solid tumors, is based on enzymes that, when properly stimulated, produce reactive oxygen species, normally present in the human body, but whose overproduction leads to cell death. Transporting these inactive enzymes directly to the tumor site, via nanocarriers, and stimulating their action in situ is the basis of the oxidative therapy. Specifically, the reference enzyme in this work is the 'D-amino acid oxidase' (DAAO) which catalyzes the deamination of D-amino acids, with the production of hydrogen peroxide. This enzyme, having as its substrate the D-amino acids, present in the human body at micromolar or submicromolar concentrations, has a highly controllable activity. To transport DAAO directly to the tumor site, it was adsorbed on the surface of nanodiamonds (NDs), properly functionalized with polyethylene glycol (PEG), hyaluronic acid (HA) and poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA), to reduce their aggregation and increase their biocompatibility. Cytotoxicity and induction of oxidative stress by H2O2 production was tested on several cell lines, both human tumoral and not tumoral, as a control. One of the key aspects of designing nanosystems for the drug delivery through the bloodstream is the study of how such nanosystems interact with biological fluids, such as plasma. In fact, once injected into the systemic circulation, nanoparticles (NPs) interact with plasma proteins, which form a protein layer around the NPs’ surface, called protein corona (PC), or bio-corona. Since the PC confers a biological identity to NPs and it influences their fate in vivo, it is essential to study its characteristics, in terms of thickness and composition. Moreover, several works in the literature showed how the presence of PC could promote the interaction between NPs and cell surface, with the consequent increase of the cytotoxic effect. In this work, HA-NDs-DAAO, PEG-NDs-DAAO and PGMA-NDs-DAAO were incubated in human serum and PCs’ composition was studied via nLC-MS/MS. Both the adsorption of DAAO and the different functionalization influenced the composition of PC, which seemed to increase the oxidative stress and the cytotoxicity induced by the tested nanosystems on human breast cancer (SKBR3), probably favoring the interaction of f-NDs-DAAO with tumor cells, thanks to the presence in the PC of proteins involved in cell adhesion. PEG-NDs-DAAO would appear to be a promising anti-tumor nanosystem, coupling a biocompatible PC, to prolong the time of circulation in the blood and good cytotoxicity against human breast cancer cells.

Enzyme-activated prodrug therapy (EPT), una nuova frontiera nella lotta contro i tumori solidi, si basa su enzimi che, opportunamente stimolati, producono specie reattive all’ossigeno, normalmente presenti nel corpo umano, ma la cui sovrapproduzione porta alla morte cellulare. Trasportare questi enzimi in stato inattivo direttamente nel sito tumorale, tramite nanotrasportatori, e stimolare in sito la loro azione è alla base della terapia ossidativa. Nello specifico di questo progetto, l’enzima di riferimento è la ‘D-amminoacido ossidasi’ (DAAO) che catalizza la deaminazione dei D-amminoacidi, con produzione di acqua ossigenata. Questo enzima, avendo come substrato i D-amminoacidi, presenti nel corpo umano a concentrazioni micromolari o submicromolari, ha un’attività altamente controllabile. Per trasportare la DAAO direttamente nel sito tumorale, è stata adsorbita sulla superficie di nanodiamanti (NDs), opportunamente funzionalizzati con polyethylene glycol (PEG), acido ialuronico (HA) e poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA), per ridurne l’aggregazione e incrementarne la loro biocompatibilità. La citotossicità e l’induzione di stress ossidativo, tramite produzione di H2O2, sono state testate su diverse linee cellulari, sia tumorali umane, che non tumorali, come controllo. Uno degli aspetti chiave del design di sistemi per il trasporto di farmaci attraverso il circolo sanguigno è lo studio di come tali nanosistemi interagiscono con i fluidi biologici, come il plasma. Infatti, una volta iniettate nel circolo sistemico, le nanoparticelle (NPs) interagiscono con le proteine del plasma, che formano uno strato proteico attorno alla superficie delle NPs, detto corona proteica (PC), o bio-corona. Dal momento che la corona proteica conferisce alle NPs un’identità biologica e influenza il loro destino in vivo, è essenziale studiarne le caratteristiche, in termini di spessore e composizione. Inoltre, diversi lavori in letteratura hanno dimostrato come la presenza del PC potrebbe favorire l’interazione tra NPs e superficie cellulare, con il conseguente incremento dell’effetto citotossico. In questo lavoro, HA-NDs-DAAO, PEG-NDs-DAAO e PGMA-NDs-DAAO sono stati incubati nel siero umano e la composizione del PC è stata studiata tramite nLC-MS/MS. Sia l'adsorbimento di DAAO che la diversa funzionalizzazione hanno influenzato la composizione del PC, che sembrerebbe aver incrementato lo stress ossidativo e la citotossicità indotta dai nanosistemi testati contro il carcinoma mammario umano (SKBR3), favorendo probabilmente l'interazione dei f-NDs-DAAO con le cellule tumorali, grazie alla presenza nel PC di proteine coinvolte nell’adesione cellulare. PEG-NDs-DAAO sembrerebbe essere un promettente nanosistema antitumorale, accoppiando un PC biocompatibile, per prolungare il tempo di circolazione nel sangue e una buona citotossicità contro le cellule di cancro al seno umano.