Towards next generation of time resolved system for biophotonics applications

Time-domain diffuse optics (TD-DO) is a non-invasive technique for analyzing diffuse samples, such as biological tissue. It uses picosecond laser pulses (10-100 ps) to measure the temporal distribution of re-emitted photons (distribution of time of flight, DTOF). Compared to continuous wave techniques, TD-DO provides rich information, allowing for the separation of absorption and scattering coefficients and probing up to 6 cm deep. This makes it suitable for examining internal organs like the heart or lungs, which are otherwise inaccessible optically. Historically, TD-DO faced limitations due to low light-harvesting capabilities and slow timing electronics. Modern advancements in detectors and timing electronics have overcome these issues, allowing for high quality signal collection. The temporal signal is reconstructed using time-correlated single-photon counting (TCSPC), where each photon’s arrival time is recorded into a histogram. Traditional TCSPC systems, however, cannot record multiple photons in a single cycle, leading to pile-up distortion, which is mitigated by maintaining a low photon counting rate. To address pile-up distortion, increasing the distance between the light source and detector has been proposed, facilitating transmittance measurements, and enhancing light collection efficiency. A detector with a large active area (100 mm²) has been validated for fruit ripeness assessment, achieving a maximum thickness of 9.6 cm. This approach may simplify non-contact detection and reduce sensitivity to artifacts. Otherwise, to address pile up distortion, post-processing techniques, such as Coates algorithm, is proposed to correct DTOFs shape. It enables accurate analysis even under high signal intensity. An optimal counting rate of 83% has been identified for detecting localized perturbations, with experiments confirming minimal error rates and high data accuracy under extreme conditions. A pseudo-wearable TD-DO system, using a 256-channel Single Photon Avalanche Diode (SPAD) line sensor and CMOS driver with an 800 nm laser diode, was tested in high-throughput regimes, achieving a photon count rate of 83% and demonstrating precise perturbation detection. This system also successfully detected heartbeat-induced absorption and scattering changes in resting-state measurements, marking a first for compact, wearable instruments. Additionally, the high-throughput TCSPC Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) system, using a compressive single-pixel camera with a SiPM detector, enabled wide-field FLIM at 20 frames per second. This allowed real-time fluorescence lifetime estimates and dynamic sample monitoring. A multifunctional time-resolved single-photon detection chain with 16 channels was developed, supporting both multispectral fluorescence lifetime imaging and TD-DO applications. With optimized single-photon timing resolution, it effectively recorded fluorescence emission spectra and fluorescence lifetimes of dynamic samples, aligning with cutting edge technologies for TD-DO applications. In conclusion, this thesis work leverages recent technological and computational advancements to enhance non-invasive time-resolved biophotonic applications, paving the way for simplified non-contact detection and real-time physiological monitoring.

La spettroscopia ottica diffusa nel dominio del tempo (TD-DO) è una tecnica non invasiva per analizzare campioni diffusi, come i tessuti biologici. Essa utilizza impulsi laser di pochi picosecondi (10-100 ps) per misurare la distribuzione temporale dei fotoni riemessi (distribuzione del tempo di volo, DTOF). Rispetto alla tecnica in continua, la TD-DO fornisce molte più informazioni e permette di separare con una singola misura i coefficienti di assorbimento e scattering e di sondare fino a 6 cm di profondità. Questo la rende adatta ad esaminare organi interni come il cuore o i polmoni, altrimenti inaccessibili otticamente. Storicamente, l'uso della TD-DO è stato limitato a causa delle basse capacità di raccolta della luce e di una elettronica di temporizzazione lenta. I progressi degli ultimi anni nei rivelatori e nell'elettronica di temporizzazione hanno superato questi problemi, permettendo la raccolta di segnali di alta qualità. Il segnale temporale viene ricostruito utilizzando la tecnica time correlated single photon counting (TCSPC), dove il tempo di arrivo di ogni fotone viene registrato in un istogramma. Tuttavia, i sistemi TCSPC tradizionali non possono registrare più fotoni in un singolo ciclo. Se tale condizione non è soddisfatta, la DTOF ricostruita è distorta. Le possibili distorsioni vengono, usualmente, mitigate mantenendo un basso tasso di conteggio dei fotoni. Una prima modalità per mitigare la distorsione descritta in questa tesi, è l'aumento della distanza tra la sorgente e il rivelatore. Questo facilita la misura in trasmittanza. Un rivelatore con un'ampia area attiva (100 mm²) è stato convalidato per valutare il grado di maturità della frutta, raggiungendo uno spessore massimo di 9.6 cm. Questo approccio può semplificare le misure senza contatto e ridurre la sensibilità agli artefatti. In alternativa, un secondo modo di mitigare la distorsione della DTOF, è l'uso di tecniche di post-elaborazione, come l'algoritmo di Coates, per correggere la forma della DTOF. Questo approccio permette un'analisi accurata anche usando un segnale molto intenso. Un tasso di conteggio ottimale dell'83% è stato individuato per rilevare perturbazioni localizzate, anche mediante esperimenti, che confermano errori minimi e alta precisione. Sfruttando tale modalità, è stato testato a regimi di acquisizione veloce un sistema pseudo-indossabile TD-DO, basato su un sensore lineare di single photon avalanche diode (SPAD) a 256 canali e un driver CMOS con un diodo laser da 800 nm. E' stato possibile raggiungere un tasso di conteggio dei fotoni dell'83% ed è stata dimostrata una rivelazione precisa delle perturbazioni. Questo sistema ha anche rilevato con successo variazioni di assorbimento e scattering indotte dal battito cardiaco in misurazioni a riposo, segnando un unicum per strumenti compatti e indossabili. Inoltre, un sistema TCSPC di microscopia per imaging del tempo di vita di fluorescenza (FLIM) ad alto rendimento, che utilizza una fotocamera a singolo pixel con un rilevatore SiPM, ha permesso di acquisire misure wide-film FLIM a 20 fotogrammi al secondo. Questo ha consentito stime in tempo reale della durata della fluorescenza e il monitoraggio dinamico dei campioni. Infine, una catena di rilevazione multifunzionale a singolo fotone risolta nel tempo con 16 canali è stata sviluppata, supportando sia la FLIM multispettrale che le applicazioni TD-DO. Con una risoluzione temporale ottimizzata per il singolo fotone, ha registrato efficacemente spettri di emissione di fluorescenza e durate di fluorescenza di campioni dinamici, allineandosi con le tecnologie all'avanguardia per le applicazioni TD-DO. In conclusione, questo lavoro di tesi sfrutta i recenti avanzamenti tecnologici e computazionali per migliorare le applicazioni biofotoniche non invasive risolte nel tempo, aprendo la strada a una rilevazione senza contatto semplificata e al monitoraggio fisiologico in tempo reale.