Femtosecond laser micromachining of an integrated high throughput microscope for liquid biopsy

In recent years, the analysis of circulating tumor cells using liquid biopsy has opened new avenues for understanding the intricate mechanisms involved in the development and proliferation of cancer metastases. Despite numerous advances, there is still no system that allows for a rapid and reliable detection of these cells in the blood in any biology laboratory. The aim of this thesis work is to develop a high-throughput microscope capable of identifying tumor cells based on cytomorphological criteria rather than phenotypic markers. To this end, a variant of the "time-stretch imaging" technique has been applied, which enables high-flow cellular imaging by using a spatial and temporal encoding of the pulses. Specifically, an integrated device was developed capable of generating a train of temporally equispaced pulses from a single 10 ns laser pulse, thereby illuminating the entire cell surface at different moments. Thanks to temporal encoding, it was possible to use a single-pixel detector, significantly enhancing the speed performance compared to conventional medical imaging techniques. All optical components were fabricated using femtosecond laser micromachining on a borosilicate glass substrate; by irradiating with ultrafast pulses, it is possible to modify the refractive index of the medium and create complex waveguide structures. The spatial and temporal resolution of the final device, measured using a calibration target and a photodiode, turned out to be sufficiently high to potentially allow the analysis of hundreds of thousands of cells per second.

Negli ultimi anni, l’analisi delle cellule tumorali circolanti con biopsia liquida ha aperto le porte alla comprensione degli intricati meccanismi coinvolti nello sviluppo e nella proliferazione delle metastasi tumorali. Nonostante i numerosi progressi compiuti, ad oggi non esiste ancora un sistema che consenta di avere, in qualsiasi laboratorio di biologia, un riscontro rapido e affidabile della presenza di queste cellule nel sangue. Questa tesi ha come obiettivo lo sviluppo di un microscopio ad alto throughput, capace di identificare le cellule tumorali basandosi su criteri citomorfologici piuttosto che su marcatori fenotipici. Per tale scopo è stata applicata una variante della tecnica "time-stretch imaging", la quale permette di ottenere immagini cellulari ad alto flusso utilizzando una codifica spaziale e temporale degli impulsi. In particolare, è stato sviluppato un dispositivo integrato capace di ottenere un treno di impulsi temporalmente equispaziati partendo da un singolo impulso laser di 10 ns, in modo da illuminare tutta la superficie cellulare a istanti differenti. Grazie alla codifica temporale, è stato possibile utilizzare un rivelatore a singolo pixel, incrementando notevolmente le prestazioni rispetto alle convenzionali tecniche di imaging cellulare. Tutte le componenti ottiche sono state fabbricate mediante microlavorazione laser a femtosecondi su un substrato in vetro borosilicato; grazie all’irraggiamento con impulsi ultraveloci è possibile modificare l’indice di rifrazione del mezzo e ottenere strutture più o meno complesse di guide d’onda. La risoluzione spaziale e temporale del dispositivo finale, misurata tramite un target di calibrazione e un fotodiodo, è risultata essere sufficientemente elevata da potenzialmente permettere l’analisi di centinaia di migliaia di cellule al secondo.