Development of microfluidic platforms for the vascularization of a colorectal cancer spheroid-on-chip

Colorectal cancer (CRC) is the second leading cause of cancer-related mortality worldwide, with a 5-year survival rate of 14% for patients with metastatic disease. The ineffectiveness of therapeutic approaches can be partially attributed to the relatively slow drug discovery process and the use of reductionistic preclinical models that fail to adequately recapitulate the complexity of the tumor microenvironment (TME). Multicellular tumor spheroids are widely employed to model avascular tumor nodules or metastatic foci due to their metabolic and proliferation gradients distribution, but they fail to recapitulate the interactions of cancer cells with the extracellular matrix. Organs-on-chips enable the investigation of the dynamic interplay between tumor cells and tumor-associated stromal cells, enabling direct interaction in a three-dimensional setting that incorporate physical cues and biochemical signals originating from both the tumor and its supporting TME. The objective of this thesis was to design and validate microfluidic platforms suitable for the vascularization of CRC spheroids to emulate the heterogenic TME and reconstruct the physiological functions of a micro-vascularized tissue. The proposed platforms allowed for the co-culture of spheroids and endothelial cells (ECs), enabling angiogenesis and vasculogenesis to be modeled in a controlled microenvironment, thus overcoming one of the inherent limitations of 3D spheroids models – the lack of perfusable vasculature. In the absence of exogenous VEGF and tumor-associated stromal cells paracrine signaling, angiogenic sprouting arising from an established vessel failed to reach and merge with the spheroids. Instead, the self-assembly of ECs embedded in a fibrin hydrogel resulted in the vascularization of the spheroids, facilitating cell survival and proliferation. The observed changes in spheroid morphology, coupled with the down-regulation of epithelial markers, indicated the activation of epithelial-to-mesenchymal pathways in spheroids co-cultured with ECs, thereby validating the organ-on-chip models as effective tools for investigating mechanisms underlying cancer metastasis.

Il cancro del colon-retto (CRC) è il secondo tumore per mortalità al mondo, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni dalla diagnosi del 14% per i pazienti con malattia metastatica. L'inefficacia degli approcci terapeutici è in parte da attribuire alla lentezza del processo di scoperta dei farmaci e all'uso di modelli preclinici riduzionistici, incapaci di riprodurre la complessità del microambiente tumorale (TME). Gli sferoidi tumorali multicellulari sono ampiamente utilizzati come modelli preclinici di noduli tumorali avascolari in virtù della distribuzione dei loro gradienti metabolici e di proliferazione, ma mancano di interazioni cruciali con la matrice extracellulare. Gli organi su chip consentono di studiare l'interazione dinamica tra le cellule tumorali e le cellule stromali della nicchia tumorale, permettendo la loro interazione in un ambiente tridimensionale che incorpora segnali fisici e biochimici provenienti sia dal tumore che dal TME di supporto. L'obiettivo di questa tesi è progettare e validare piattaforme microfluidiche adatte alla vascolarizzazione di sferoidi di CRC, al fine di emulare il TME eterogeneo del colon-retto e ricostruire le funzioni fisiologiche di un tessuto microvascolarizzato. Le piattaforme proposte hanno permesso la co- coltura sferoidi e cellule endoteliali (ECs), consentendo di riprodurre i processi di angiogenesi e vasculogenesi in un microambiente controllato, risolvendo uno dei limiti intrinseci degli sferoidi: la mancanza di una vascolarizzazione. In assenza di VEGF esogeni e di segnalazione paracrina da parte di cellule stromali, l’angiogenesi delle ECs è risultata insufficiente, mentre l’assemblaggio delle ECs secondo vasculogenesi in un idrogel di fibrina ha portato alla vascolarizzazione degli sferoidi, migliorandone la sopravvivenza e la proliferazione. I cambiamenti morfologici osservati negli sferoidi, insieme alla riduzione dell'espressione di marker epiteliali, indicano l'attivazione della transizione epitelio-mesenchimale (EMT) negli sferoidi co-coltivati con ECs, convalidando così i modelli di organi- su-chip come strumenti efficaci per studiare i meccanismi alla base delle metastasi tumorali.