Coherent Raman microscopy : from set-up development to applications

Non-linear optical microscopy techniques like Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) are highly effective tools for label-free vibrational imaging, enabling chemical analysis of unperturbed biological samples. In the first part of this thesis I present present video-rate wide-field CARS signal generation and collection, allowing chemically-specific realtime characterization of fast dynamics with down to few ms time resolution, over a wide field of view (tens of μm). At the VIBRA lab at Politecnico di Milano, I employ an amplified femtosecond ytterbium laser source providing high energy (≈ μJ) pulses in the near-infrared at 1035 nm central wavelength and 2-MHz repetition rate. Narrowband 1.1 nm (10 cm−1) FWHM pump pulses ensure appropriate spectral resolution for the vibrational peaks. Broadband Stokes pulses in the 1100-1500nm range are created via supercontinuum generation in a 10-mm YAG crystal targeting the informative fingerprint region of the vibrational spectrum. Multiplex CARS is achieved via rapid Stokes detuning though a 4f pulse-shaper, allowing single-wavelength real-time and chemically-specific image acquisition of heterogeneous samples. Targeting the main Raman peaks of three known chemical compounds, we reconstruct false-color images chemically distinguishing the different components. In the second part of this work, exploiting the inherently quantitative and qualitative nature of SRS, at the Streets Lab at UC Berkeley, I employ a spectral-focusing approach to investigate the effects of fixation on a HeLa cell model. Understanding their intrinsic impact is crucial for comprehensive characterization, mitigating unwanted bias in assays involving multi-modal or orthogonal sample studies. Detecting the Stimulated Raman Loss (SRL), I quantify main changes in morphology and variations in protein-lipid concentrations, through the 2920 cm−1 and 2850 cm−1 peak respectively, in the CH spectral region of the vibrational spectrum. Employing a range of commonly used fixatives in biology like Paraformaldehyde, Formalin, Glutaraldehyde, preferred for imaging, or Ethanol and Methanol, of choiche in immunohistochemistry, I observe that cross-linking fixatives preserve the best chemical and morphological features closest to those of live cells. Alcohols, commonly employed in DNA and RNA sequencing scenarios, have the most pronounced effect on cell structure. This study offers a robust framework for experimental design in future biological investigations.

Le tecniche di microscopia ottica non lineare come il Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) e lo Stimulated Raman Scattering (SRS) sono strumenti molto efficaci per l'imaging vibrazionale privo di etichette, consentendo l'analisi chimica di campioni biologici non perturbati. Nella prima parte di questa tesi presento la generazione e la raccolta di segnali CARS Wide-Field con elevate velocità, consentendo la caratterizzazione in tempo reale di dinamiche veloci e specifiche dal punto di vista chimico con una risoluzione temporale fino a pochi ms, su un ampio campo visivo (decine di μm). Presso il laboratorio VIBRA del Politecnico di Milano, utilizzo una sorgente laser a femtosecondi (Ytterbium amplified) che fornisce impulsi ad alta energia (≈ μJ) nel vicino infrarosso con lunghezza d'onda centrale di 1035 nm e frequenza di ripetizione di 2 MHz. Gli impulsi di pompa a banda stretta con FWHM di 1,1 nm (10 cm-1) garantiscono un'adeguata risoluzione spettrale per i picchi vibrazionali. Impulsi Stokes a banda larga nell'intervallo 1100-1500nm sono creati tramite generazione di supercontinuum in un cristallo YAG da 10 mm, mirando all’informativa regione fingerprint dello spettro vibrazionale. Multiplex CARS è ottenuta tramite un rapido detuning dei fasci Stokes attraverso un pulse-shaper 4f, consentendo l'acquisizione di immagini in tempo reale a singola lunghezza d'onda e chimicamente specifiche di campioni eterogenei. Mirando ai principali picchi Raman di tre composti chimici noti, ricostruiamo immagini in falsi colori che distinguono chimicamente i diversi componenti. Nella seconda parte di questo lavoro, sfruttando la natura intrinsecamente quantitativa e qualitativa dello SRS, presso lo Streets Lab dell'UC Berkeley, utilizzo un approccio spectral focusing per studiare gli effetti del fissaggio su un modello di cellule HeLa. La comprensione del loro impatto intrinseco è fondamentale per una caratterizzazione completa, attenuando i bias indesiderati negli studi che prevedono analisi multimodali e ortogonali su campioni. Rilevando la Stimulated Raman Loss (SRL), quantifico i principali cambiamenti nella morfologia e le variazioni nelle concentrazioni di proteine e lipidi, attraverso i picchi a 2920 cm-1 e 2850 cm-1 rispettivamente, nella regione spettrale CH dello spettro vibrazionale. Impiegando una serie di fissativi comunemente utilizzati in biologia come la Paraformaldeide, la Formalina, la Glutaraldeide, preferita per l'imaging, o l'Etanolo e il Metanolo, scelti per l'immunoistochimica, ho osservato che i fissativi a reticolazione conservano al meglio le caratteristiche chimiche e morfologiche più vicine a quelle delle cellule vive. Gli alcoli, comunemente utilizzati negli scenari di sequenziamento del DNA e dell'RNA, hanno l'effetto più pronunciato sulla struttura cellulare. Questo studio offre un quadro robusto per la progettazione di esperimenti in future indagini biologiche.