Computational imaging based multispectral fluorescence lifetime microscope

In this thesis work we explore advancements in multispectral fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) exploiting computational imaging techniques. This was done working on a multispectral FLIM system based on a single pixel camera (SPC) implementation. The possibility of acquiring optically sectioned images using structured light illumination microscopy (SIM) is explored. The depth of field is improved without modifying the optical setup. This is done projecting on the sample sinusoidal patterns. With the highest spatial frequency we are able to obtain a depth of field of 1.5 micrometers. Additionally, we propose a data fusion algorithm, enabling the merging of high-resolution CMOS images with the spectral and temporal data from the single pixel camera acquisition. This approach resulted in a 5D multispectral time-resolved dataset with significantly enhanced spatial resolution. This algorithm was tested on fluorescent beads and on a kidney cells slide. After data fusion, the spectral and temporal information were correctly maintained, effectively compensating for the inherent spatial resolution limitations of single pixel imaging. This was the case even in SPC measurements with a compression ratio up to 70%. Further improvements are needed in the algorithm to increase the accuracy. In any case, the achieved results demonstrate the potential for a more detailed and accurate multispectral FLIM microscopy using cost-effective experimental setups and minimal acquisition times.

In questo lavoro di tesi esploriamo possibili progressi nella fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) multispettrale, sfruttando tecniche di imaging computazionale. Ciò è stato fatto lavorando su un sistema FLIM multispettrale basato su una single pixel camera (SPC). Viene esplorata la possibilità di acquisire immagini con sezionamento ottico utilizzando la microscopia a luce strutturata (structured light illumination microscopy, SIM). La profondità di campo è migliorata senza cambiare il setup sperimentale, proiettando sul campione pattern sinusoidali. Con la frequenza spaziale più elevata otteniamo una profondità di campo di 1.5 micrometri. Inoltre, proponiamo un algoritmo di data fusion che permette l’unione di immagini CMOS ad alta risoluzione con i dati spettrali e temporali ottenuti con l'acquisizione SPC. Con questo approccio si ottiene un dataset 5D multispettrale risolto nel tempo con una risoluzione spaziale significativamente migliorata. L'algoritmo è stato testato su perline fluorescenti e su un vetrino di cellule renali. Dopo il data fusion, le informazioni spettrali e temporali vengono mantenute correttamente, compensando efficacemente i limiti intrinseci di risoluzione spaziale della single pixel imaging. Questi risultati sono stati ottenuti anche in misure SPC con un rapporto di compressione fino al 70%. Sono necessari ulteriori miglioramenti per aumentare l’accuratezza dell’algoritmo. In ogni caso, i risultati ottenuti sono promettenti per una microscopia FLIM multispettrale più dettagliata e accurata utilizzando setup sperimentali economici e con tempi di acquisizione minimi.