In vitro modulation of macrophage phenotype by 3d custom-made photo-polymerised microscaffolds

The foreign body reaction (FBR) is an immune system response that can be triggered by implanted medical devices that are recognised as foreign bodies once implanted inside the organism, which is primarily mediated by macrophage activity under chronic inflammatory conditions. This study investigates how biomaterial properties, specifically the pore size of porous biomaterials, can influence macrophage behaviour and phenotypic variations. The aim of this study is to understand the impact of different pore sizes on macrophage phenotype, the associated inflammatory response, and cell morphology, in order to assess how this physical characteristic can modulate the inflammatory reaction and macrophage behaviour. The experimental in vitro study was conducted using two different 3D microstructures with distinct pore sizes: 50x50x20 µm3 and 15x15x15 µm3. Macrophages were chemically stimulated with lipopolysaccharide (LPS) and interleukin-4 (IL-4) to induce the pro-inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 phenotypes, respectively, as this is a standard approach to promote macrophage polarisation. Macrophage phenotypes were then analysed by quantifying the expression levels of two different biomarkers: the Arginase-1 (Arg1) enzyme for M2, and the inducible nitric oxide synthase (iNOS) enzyme for M1, using indirect fluorescence immuno-staining and confocal microscopy. The results showed that the macrophages cultured within both porous 3D microstructures required a chemical activation to respond to the physical stimulation. The 50x50x20 µm3 pore-sized microstructure promoted the anti-inflammatory M2 phenotype, whereas the 15x15x15 µm3 pore-sized microstructure predominantly induced the pro-inflammatory M1 phenotype. Furthermore, morphological analysis revealed distinct shapes for macrophages: M0 macrophages were primarily circular and round-shaped, M1 macrophages exhibited a spread morphology with numerous membrane extensions, and M2 macrophages were elongated and oval-shaped, with numerous filopodia. Particularly, the smaller pores of the 15x15 microstructures significantly limited macrophage expansion and elongation, creating a more confined and stressful environment, which is favourable for M1 polarisation. In contrast, 50x50 microstructures allow macrophages to elongate due to the larger pore size and the cells attempting to attach to the walls on opposite sides, favouring M2 polarisation. This study demonstrates that the pore size of the porous 3D microstructures significantly affects the macrophage phenotypic response and morphology. These findings suggest that biomaterial design can be optimised to modulate the FBR outcome, to enhance tissue integration, and influence the macrophage behaviour through both phenotypic and morphological changes.

La reazione da corpo estraneo (FBR) è una risposta del sistema immunitario che può essere attivata dai dispositivi medici impiantabili che vengono riconosciuti come corpi estranei quando impiantati all’interno dell’organismo, mediata principalmente dall'attività dei macrofagi in condizioni di infiammazione cronica. Questo studio esplora come le proprietà dei biomateriali, in particolare la dimensione dei pori dei biomateriali porosi, possano influenzare il comportamento e le variazioni fenotipiche dei macrofagi. L'obiettivo di questo studio è comprendere l'impatto delle diverse dimensioni dei pori sul fenotipo dei macrofagi, sulla risposta infiammatoria associata e sulla morfologia cellulare, al fine di valutare come questa caratteristica fisica possa modulare la reazione infiammatoria e il comportamento dei macrofagi. È stato condotto uno studio sperimentale in vitro utilizzando due microstrutture 3D porose con dimensioni dei pori differenti: 50x50x20 µm3 e 15x15x15 µm3. I macrofagi sono stati stimolati chimicamente con lipopolisaccaride (LPS) e interleuchina-4 (IL-4) per indurre i fenotipi pro-infiammatori M1 e antinfiammatori M2, rispettivamente, seguendo un approccio standard per promuovere la polarizzazione dei macrofagi. I fenotipi dei macrofagi sono stati analizzati quantificando i livelli di espressione di due biomarcatori: l'enzima Arginasi-1 (Arg1) per M2 e l'enzima sintasi dell'ossido nitrico inducibile (iNOS) per M1, utilizzando marcatura immunofluorescente indiretta e microscopia confocale. I risultati hanno mostrato che i macrofagi coltivati all'interno di entrambe le microstrutture 3D porose richiedevano un'attivazione chimica per rispondere allo stimolo fisico. La microstruttura con pori di dimensioni 50x50x20 µm3 ha favorito il fenotipo antinfiammatorio M2, mentre la microstruttura con pori di dimensioni 15x15x15 µm3 ha prevalentemente indotto il fenotipo pro-infiammatorio M1. Inoltre, l'analisi morfologica ha rivelato forme distinte per i macrofagi: i macrofagi M0 erano principalmente circolari e rotondi, i macrofagi M1 presentavano una morfologia espansa con numerose estensioni della membrana, e i macrofagi M2 erano allungati e ovali, con numerosi filopodi. In particolare, i pori più piccoli delle microstrutture 15x15 hanno limitato significativamente l'espansione e l'allungamento dei macrofagi, creando un ambiente più confinato e stressante, favorevole alla polarizzazione verso M1. Al contrario, le microstrutture 50x50 permettono ai macrofagi di allungarsi grazie alla maggiore dimensione dei pori e al tentativo delle cellule di attaccarsi alle pareti opposte del poro, favorendo la polarizzazione verso M2. Questo studio dimostra che la dimensione dei pori delle microstrutture 3D porose influisce significativamente sulla risposta fenotipica e sulla morfologia dei macrofagi. Questi risultati suggeriscono che il design dei biomateriali può essere ottimizzato per modulare l'esito della FBR, migliorare l'integrazione dei tessuti e influenzare il comportamento dei macrofagi attraverso cambiamenti fenotipici e morfologici.