An innovative Fourier-transform hyperspectral microscope for excitation and emission spectroscopy

There are two approaches to measure the light spectrum. Dispersive spectroscopy separates the spectral components with dispersive elements. Fourier transform (FT) spectroscopy is a time-domain technique in which the spectrum is retrieved with the FT of the interference signal between two replicas of the radiation field, retarded by a variable delay in the two arms of an interferometer. This second approach brings in some relevant advantages in terms of throughput, signal-to-noise ratio, wavelength accuracy and tunable spectral resolution. Ordinary FT spectrometers are based on double-beam interferometers in which the two replicas travel along different paths; this causes problems in maintaining the interferometric stability between the two arms due to perturbations and vibrations. Politecnico di Milano and CNR developed a compact and ultrastable common-path birefringent interferometer (TWINS) that overcomes instability issues. It also enables a practical implementation of a hyperspectral imaging system in which the continuous spectrum of the light is recorded in parallel for all pixels of a 2D sensor. Since it provides both spectral and spatial information, spectral imaging is a versatile tool that has been applied to various fields, from microscopy to remote sensing. In this Master’s degree thesis we describe a multimodal FT hyperspectral microscope based on TWINS. Previous works already reported its versatility for reflectance, transmission, Raman and fluorescence emission measurements. Here, we aim to introduce an additional functionality: the acquisition of excitation spectra. This is obtained by temporally modulating a broadband source with a TWINS interferometer added in the illumination path of the microscope. Excitation-resolved measurements typically provide complementary information to fluorescence emission spectroscopy. Still, there are cases in which they are preferable. For example, one advantageous aspect is the higher signal-to-noise ratio under equal incident power conditions. Moreover, they can be useful to discriminate a number of targets in the same field of view that have overlapping emission spectra. Typical excitation spectra are acquired by scanning the excitation wavelength and collecting the fluorescence signal in a narrowband spectral region; here, we adopt a time-domain approach in which all wavelengths, processed by an interferometer, excite the sample simultaneously. A microscope for emission and excitation spectroscopy appears a promising tool for sample investigation. We describe its implementation and present various measurements to demonstrate its multimodality, including tests to characterise and validate the efficacy of the FT excitation method.

Esistono due approcci per misurare lo spettro della luce. La spettroscopia dispersiva separa le componenti spettrali tramite elementi dispersivi. La spettroscopia a trasformata di Fourier è una tecnica nel dominio del tempo in cui lo spettro viene ottenuto come trasformata di Fourier del segnale di interferenza tra due repliche del campo di radiazione, ritardate di un ritardo variabile nei due bracci di un interferometro. Questo secondo approccio presenta alcuni vantaggi rilevanti in termini di throughput, rapporto segnale-rumore e possibilità di regolare la risoluzione spettrale. I comuni spettrometri a trasformata di Fourier si basano su interferometri in cui le due repliche viaggiano lungo percorsi diversi; questo causa problemi nel mantenere la stabilità interferometrica tra i due bracci a causa di perturbazioni e vibrazioni. Il Politecnico di Milano e il CNR hanno sviluppato un interferometro compatto e ultrastabile, a cammino ottico comune e birifrangente (TWINS) che supera i problemi di instabilità tipici di un interferometro con bracci distinti per le due repliche. Questo dispositivo consente anche l’implementazione pratica di un sistema di imaging iperspettrale in cui lo spettro continuo della luce viene registrato in parallelo per tutti i pixel di un sensore 2D. Poiché fornisce informazioni sia spettrali sia spaziali, l’imaging spettrale è uno strumento versatile applicato in vari campi, dalla microscopia al telerilevamento. In questa tesi magistrale descriviamo un microscopio iperspettrale a trasformata di Fourier multimodale basato sul TWINS. Precedenti pubblicazioni hanno mostrato la sua versatilità per misure di riflettanza, trasmissione, Raman e emissione di fluorescenza. Qui, il nostro obiettivo è di introdurre una funzionalità aggiuntiva: l’acquisizione di spettri di eccitazione mediante la modulazione temporale di una sorgente a banda larga con un interferometro TWINS aggiunto nel ramo di illuminazione del microscopio. Le misure risolte in eccitazione forniscono generalmente informazioni complementari alla spettroscopia di emissione di fluorescenza; tuttavia, ci sono casi in cui sono preferibili. Ad esempio, un aspetto vantaggioso è il rapporto segnale-rumore più elevato a parità di potenza incidente sul campione. Inoltre, possono essere utili per discriminare diversi target nello stesso campo di vista che si sovrappongono nello spettro di emissione. Gli spettri di eccitazione sono tipicamente acquisiti scansionando la lunghezza d’onda di eccitazione e raccogliendo il segnale di fluorescenza in una banda spettrale stretta; qui, adottiamo un approccio nel dominio del tempo in cui tutte le lunghezze d’onda, processate da un interferometro, eccitano il campione simultaneamente. Un microscopio per spettroscopia di emissione ed eccitazione sembra dunque uno strumento promettente per l’indagine dei campioni. Ne descriviamo l’implementazione e presentiamo varie misure per dimostrarne la multimodalità, inclusi test preliminari per caratterizzare e validare l’efficacia del sistema per l’analisi degli spettri di eccitazione.