The role of focal adhesions and actin network in single cell migration

The ability of cells to migrate, or to move their subcellular components, is an essential aspect in all organisms both in physiological processes, such as embryogenic development, but also pathological conditions, namely cancer metastasis. Hence, a deep understanding of migration and the underlying molecular mechanisms results pivotal, because it allows to create models that can either describe or predict cell migration; in turn, these models can be exploited to evaluate the effect and possible clinical translation of different drugs that might be used to increase treatment efficacy. Therefore, the aim of this work is to investigate not only cell migration directly, but also study in depth the organization and the kinetics of biological structures such as focal adhesions and the actin cytoskeleton, whose interplay is known to affect locomotion. Focal adhesions (FAs) are nanostructured layered protein complexes that are present at the basal surface of adherent cells. They are not static structures, but are able to mature, changing their size, structural composition, and function. Adhesions nucleate with a minimum size of 0.1 μm2: in this stage they are defined nascent adhesion and are primarily though to be involved in cell environmental sensing. The development process allows adhesions to reach the size of 10 μm2, when different structures cluster to form the so-called fibrillar adhesions that are mainly involved in cellular force transmission. In general, more mature adhesions (size > 1 μm2) serve as a dynamic coupling site between the ECM and the internal part of the cell, as they are linked to the fibers of the actin cytoskeleton. The cytoskeleton is mainly composed by filamentous actin (F-actin) and presents two functional modules that are responsible for protrusive and contractile movements during cell migration; these movements are associated respectively with the lamellipodium, that initiates protrusion and migration, and with stress fibers and actin cortex, that are able to generate and transmit contractile forces and cellular tension. To highlight information about these structures different experimental setups were employed. Immunofluorescence of vinculin, a protein which is present at each maturation stage of adhesion sites, was performed on fixed cells, to visualize FAs and subsequently obtain organizational and morphological information employing an open-source macro on Fiji software. To study the spatial localization and kinetics of nascent adhesions, timelapse images of migrating GPF-paxillin transfected cells were employed. To extract information regarding the actin turnover in fibers present in the cytoskeleton, particularly in the cell cortex, stress fibers and throughout the length of lamellipodium, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments were performed: FRAP is a microscopy technique that allows to study the dynamics and determine the concentration and the turnover time of F-actin proteins inside the cell. Given the strong physical link between FAs and actin fibers, experiments were carried out also employing two drugs, namely Cytochalasin D, an inhibitor of actin polymerization, and Jasplakinolide, a stabilizer of the same processes, to understand weather and how a change in the regulation of the cytoskeleton could influence the characteristic and dynamics of adhesions and cytoskeleton itself. Another degree of complexity was added by employing as a culture substrate a custom-made 3D scaffold called Nichoid, which mimics the physiological niche and allows for a better translation of results to the in vivo environment. Results from the work allowed to gather information regarding the different concentrations of focal adhesion structures at different maturation stages, and at different spatial locations inside the cell. Furthermore, characteristic times of the global turnover of actin dynamics were extrapolated for different actin architectures. Overall, these results could be useful to implement a model based on actin dynamics, that employs mass balance equation, that can be furtherly used to describe and predict single cell migration.

La capacità delle cellule di migrare è un aspetto essenziale in tutti gli organismi sia nei processi fisiologici, come lo sviluppo embriogenico, sia in condizioni patologiche, come le metastasi tumorali. Pertanto, una accurata comprensione della migrazione e dei meccanismi molecolari sottostanti risulta fondamentale, perché permette di creare modelli in grado di descrivere o prevedere la migrazione; inoltre, questi modelli possono anche essere usati per valutare l’effetto e la possibile traslazione clinica di diversi farmaci, che potrebbero essere somministrati per aumentare l'efficacia di nuovi trattamenti. Lo scopo di questo lavoro è quello di studiare non solo la migrazione cellulare in sé, ma anche di approfondire la conoscenza sull'organizzazione e la cinetica di strutture biologiche come le adesioni focali e il citoscheletro di actina, la cui interazione è nota per influenzare la migrazione. Le adesioni focali (AF) sono complessi proteici nanometrici presenti alla base delle cellule aderenti. Non sono strutture statiche, ma sono in grado di maturare, cambiando la loro dimensione, composizione e funzione. Le adesioni nascono con una dimensione minima di 0.1 μm2: in questo stadio sono definite adesioni nascenti e sono principalmente coinvolte nel rilevamento di segnali provenienti dell'ambiente esterno. Il processo di sviluppo permette alle adesioni di raggiungere la dimensione massima di 10 μm2, quando diverse strutture si raggruppano per formare le cosiddette adesioni fibrillari, che sono principalmente coinvolte nella trasmissione della forza cellulare. In generale, le adesioni più mature (area > 1 μm2) rappresentano un sito di accoppiamento dinamico tra la matrice extracellulare (MEC) e la parte interna della cellula, trovandosi legate alla parte terminale delle fibre del citoscheletro di actina. Il citoscheletro è composto principalmente da actina filamentosa (F-actina) e presenta due moduli funzionali che sono responsabili dei movimenti protrusivi e contrattili durante la migrazione cellulare; questi movimenti sono associati rispettivamente al lamellipodium, che avvia la protrusione e la migrazione, e alle fibre e alla corteccia di actina che sono in grado di generare e trasmettere forze contrattili e tensione cellulare. Per evidenziare le informazioni su queste strutture sono stati realizzati diversi setup sperimentali. L'immunofluorescenza della vinculina, una proteina presente in ogni fase di maturazione dei siti di adesione, è stata eseguita su cellule fissate, per visualizzare le AF e ottenere successivamente informazioni organizzative e morfologiche utilizzando un codice open-source sul software Fiji. Per studiare la localizzazione spaziale e la cinetica delle adesioni nascenti, sono state utilizzate immagini in timelapse di cellule trasfettate con paxillina. Per estrarre informazioni sul turnover dell'actina nelle fibre presenti nel citoscheletro, in particolare della corteccia cellulare, delle fibre di actina e nel lamellipodium, sono stati eseguiti esperimenti FRAP: la FRAP è una tecnica di microscopia che permette di studiare la dinamica e determinare la concentrazione e il tempo di turnover delle proteine di F-actina all'interno della cellula. Dato il forte legame fisico tra le AF e le fibre di actina, sono stati effettuati anche esperimenti con due farmaci, la Citocalasina D, un inibitore della polimerizzazione dell'actina, e la Jasplakinolide, uno stabilizzatore degli stessi processi, per capire come e quanto un cambiamento nella regolazione del citoscheletro potesse influenzare le caratteristiche e le dinamiche delle adesioni e del citoscheletro stesso. Un ulteriore grado di complessità è stato aggiunto impiegando come substrato di coltura una struttura 3D custom-made chiamata Nichoid, che replica la nicchia fisiologica, consentendo una migliore traslazione dei risultati all'ambiente in vivo. I risultati del lavoro hanno permesso di raccogliere informazioni sulle diverse concentrazioni delle strutture di adesione focale nei diversi stadi di maturazione, ma anche in diverse posizioni spaziali all'interno della cellula. Inoltre, sono stati estrapolati i tempi caratteristici del turnover globale della dinamica dell'actina per diverse le diverse architetture cellulari. Complessivamente, questi risultati potrebbero essere utili per implementare un modello basato sulla dinamica dell'actina, che impiega l'equazione del bilancio di massa, che può essere utilizzato per descrivere e prevedere la migrazione di singole cellule.