Solution electrowriting of natural polymers for skeletal muscle tissue engineering

Tissue engineering often relies on creating constructs able to restore partially or totally a tissue or organ of interest, relying on cells, scaffolds, and signalling components. With this aim, a higher complexity degree in reproducing tissue architectures, and towards a higher scalability for high-throughput, would unlock its potential as an alternative therapeutic strategy to conventional existing ones, for a more patient-specific approach. Control in morphologies and material disposition, as obtained is direct-writing mode, is essential to replicate with high fidelity extracellular matrix, and one determinant requirement is to reach strut dimensions in the typical extracellular matrix scale, which can boost cell viability and proliferation. Direct-writing electrospinning – performed in form of either solution electrowriting or melt electrowriting – can be regarded as a way to meet both conditions: thanks to electric field application combined to XY axis motion assigned to the fiber collector, both guidance over filament deposition and extracellular matrix-like filament caliber are attained. Particularly solution electrowriting can bring to thinner fibers than melt electrowriting and other extrusion-based techniques such as wet spinning or fused deposition modeling, and opens the possibility to process even natural polymers, well-known for their cell-adhesive properties and biocompatibility given by their similar macromolecular structure to tissues, offering the convenience of recognition from the biological system compared to synthetic polymers when implanted. Despite this advantageous field of application, solution electrowriting is still far from being a standard in tissue engineering, with still few studies delving into this technique for natural polymers. Additionally, solution electrowriters are often in-house built, without shared protocols or standardized commercial platforms and data comparability amongst laboratories is halted for this reason, which consequently limits solution electrowriting spreading. Proposing a system for solution electrowriting user friendly, easy to be set up, and versatile in terms of admitted motions, would help break barriers towards a more extended use of this technique, allowing to replicate even different intricate tissue morphologies. In this work, firstly, a setup suitable for solution electrowriting was designed and developed, demonstrating control over process parameters in terms of fiber morphology and an easy placement of fibers even along curved and intricate paths. Both synthetic and natural polymer processing was possible, in form of submicrometric fibers with diameters hardly achieved with natural polymers before with solution electrowriting, and with a higher alignment degree than other common methods to obtain oriented fibers, e.g. electrospinning with parallel plates. Using a solution made by methacrylated gelatin and bovine serum albumin, multi-layered oriented scaffolds were iteratively fabricated for skeletal muscle regeneration purpose. This tissue is the ideal candidate to biologically test efficiency of solution electrowritten scaffolds, thanks to the highly aligned fibers that can be obtained with controlled fiber deposition which can provide an essential cue towards myotube maturation and complete tissue restoration. The SEW system herein developed proved guidance over seeded C2C12 cells and human myoblasts, which were viable and proliferated on samples. More work needs to be done to encourage cell differentiation into myotubes or reserve cells, which is not supported in the long term, despite being ameliorated if compared to plain substrates with no fiber patterns on top. Nevertheless, the setup is a promising, cost-effective and easy-to-use tool to fabricate extracellular matrix-like structures with any desired orientation and shape, all features that meet the needs towards more personalized and reliable approaches in regenerative medicine and tissue engineering.

Uno degli obiettivi dell'ingegneria tissutale è creare costrutti in grado di ripristinare parzialmente o totalmente un tessuto o un organo di interesse, basandosi su cellule, scaffold e segnali. A questo scopo, un grado di complessità più elevato nella riproduzione delle architetture tissutali e una maggiore scalabilità per l'high-throughput potrebbero mostrare il potenziale dell’ingegneria dei tessuti come approccio terapeutico alternativo ai convenzionali e aumentare la specificità rispetto al quadro clinico del paziente. Il controllo su forme e disposizione di materiale, ottenuto grazie alla modalità direct-writing, è essenziale per replicare con alta fedeltà la matrice extracellulare, ed un requisito determinante è quello di raggiungere dimensioni della sua struttura nella scala tipica della matrice extracellulare, che possono aumentare la vitalità e la proliferazione delle cellule. Il direct-writing electrospinning – eseguito o in forma di solution electrowritiing o di melt electrowriting – può essere considerato un modo per soddisfare entrambe le condizioni suddette: grazie all'applicazione di un campo elettrico combinato con il movimento sugli assi XY assegnato al piano di raccolta delle fibre, si ottiene sia il controllo sulla deposizione dei filamenti sia un calibro delle fibre simile alla matrice extracellulare. In particolare, il solution electrowriting può portare a fibre più sottili rispetto al melt electrowriting e ad altre tecniche basate sull'estrusione, come il wet spinning o il fused deposition modeling, e permette di processare anche polimeri naturali, ben noti per le loro proprietà di citocompatibilità e biocompatibilità: la loro struttura macromolecolare simile a quella dei tessuti biologici, infatti, permette loro di essere riconosciuti da parte dell’organismo in cui vengono impiantati rispetto ai polimeri sintetici. Nonostante questo vantaggioso campo di applicazione, il solution electrowriting è ancora lontano dall'essere uno standard nell'ingegneria tissutale, con pochi studi che approfondiscono l’uso di questa tecnica per i polimeri naturali. Inoltre, i setup per solution electrowriting sono spesso sviluppati all’interno del singolo laboratorio di ricerca, senza protocolli condivisi o piattaforme commerciali standardizzate e la comparabilità dei dati tra i laboratori è ostacolata, con una limitata diffusione della tecnica di conseguenza. La proposta di un sistema per solution electrowriting facile da usare e impostare e versatile in termini di movimenti ammessi, aiuterebbe a infrangere le barriere che prevengono un uso più esteso di questa tecnica, consentendo di replicare anche diverse morfologie tissutali intricate con elevata risoluzione. In questo lavoro, in primo luogo, è stata progettata e sviluppata un sistema adatto a effettuare solution electrowriting, che ha dimostrato il controllo dei parametri di processo in termini di morfologia delle fibre e il semplice posizionamento delle fibre anche lungo percorsi curvi e intricati. È stata possibile la lavorazione di polimeri sia sintetici che naturali, sotto forma di fibre submicrometriche con diametri difficilmente raggiunti con polimeri naturali prima d'ora tramite solution electrowriting, e con un grado di allineamento più elevato rispetto ad altri metodi comuni per ottenere fibre orientate con diametri paragonabili, come l'elettrofilatura con piastre parallele. Utilizzando una soluzione a base di gelatina metacrilata e albumina da siero bovino, sono stati fabbricati iterativamente scaffold multistrato orientati per la rigenerazione del muscolo scheletrico. Questo tessuto è il candidato ideale per testare biologicamente l'efficienza degli scaffold ottenuti via solution electrowriting: grazie alle fibre altamente allineate che possono essere ottenute con la deposizione controllata tipica di questa tecnica è possibile impartire uno stimolo essenziale per la maturazione dei miotubi e il ripristino completo del tessuto. Il setup ha poi dimostrato di saper guidare le cellule C2C12 e i mioblasti umani seminati, che sono risultati vitali e hanno proliferato sui campioni. Occorre migliorare la differenziazione delle cellule in miotubi o cellule di riserva, che non è supportata a lungo termine, nonostante sia migliorata se confrontata con substrati privi di pattern di fibre. Ad ogni modo, il sistema per solution electrowriting proposto in questa tesi è uno strumento promettente, economico e facile da usare per fabbricare strutture simili alla matrice extracellulare con qualsiasi orientamento e forma desiderati, tutte caratteristiche che rispondono alla domanda di approcci più personalizzati e affidabili nella medicina rigenerativa e nell'ingegneria dei tessuti.