Tempo derivatives in nanocarriers for drug delivery systems with antioxidant activity

Nitroxyl radical 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl, commonly known as TEMPO, is a molecule with a powerful antioxidant activity. This property can be exploited for reducing oxidative stress-driven pathologies which cause protein and lipid damage, cell death and stimulation of inflammatory signaling. However, the usage of TEMPO comes with some drawbacks, such as its rapid clearance from the body and its challenging encapsulation into polymer nanoparticles, since it is a water-soluble molecule difficult to load into hydrophobic carrier systems. In order to overcome these issues, many researches are ongoing to find the best polymers to be functionalized with TEMPO. In this study, an investigation is performed on a combination of polyethylene glycol (PEG) and linear or branched polyethyleneimine (PEI) to form stable nanogels, with the possibility of varying their grafting degree. Although the formulation for PEG-l-PEI nanogels was already proven effective by previous works conducted, the one for PEG-b-PEI ones was not, hence in this work different options, both with b-PEI 600 Da and b-PEI 25000 Da, have been investigated. This new formulation provides to the nanogels more lipophilic properties, which have been even more emphasized by coating them with derivatives of fatty acids. In order then to introduce TEMPO in the nanogels formulation, a linker containing TEMPO (2-bromo-TEMPOacetamide) was developed and then grafted to the polymer or coated on nanogels surface. Additionally, to conduct in vitrotests on nanogels, some of them have been also linked to a tracer probe such as rhodamine and cy5-azide, which has allowed to study their internalization pathway. All of these different nanogels have been then analyzed in terms of physical properties such as hydrodynamic diameter and zeta-potential by means of dynamic light scattering (DLS) anaylsis, with the aim to study their stability. Subsequently citotoxicity and antioxidant activity have been tested. The latter, investigated through ORAC tests, has been proven to be effective both with nanogels with TEMPO grafted and coated, allowing to state that TEMPO molecule preserves its antioxidant capacity when loaded on a nanocarrier such as nanogels.

Il radicale nitrosile 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl,comunemente noto come TEMPO, è una molecola con una potente attività antiossidante. Questa proprietà può essere sfruttata per ridurre le patologie indotte dallo stress ossidativo che causano danni a proteine e lipidi, morte cellulare e stimolazione dei segnali infiammatori. Tuttavia, l'uso del TEMPO comporta alcuni svantaggi, come la sua rapida eliminazione dal corpo e la difficoltà di incapsulamento in nanoparticelle polimeriche, poiché è una molecola solubile in acqua e difficile da caricare in sistemi di trasporto idrofobici. Per superare questi problemi, molte ricerche sono in corso per trovare i migliori polimeri da funzionalizzare con il TEMPO. In questo studio è stata condotta un'indagine su una combinazione di polietilenglicole (PEG) e polietilenimina (PEI) lineare o ramificata per formare nanogel stabili, con la possibilità di variare il loro grado di grafting. Sebbene la formulazione per i nanogels PEG-l-PEI fosse già stata dimostrata efficiente da lavori precedenti, quella per i nanogels PEG-b-PEI non lo era, perciò in questo lavoro sono state esplorate diverse opzioni, sia con b-PEI 600 Da che con b-PEI 25000 Da. Questa nuova formulazione conferisce ai nanogels maggiori proprietà lipofile, che sono state ulteriormente enfatizzate mediante un rivestimento coi derivati degli acidi grassi. Per introdurre il TEMPO nella formulazione dei nanogels, un linker contenente il TEMPO (TEMPO-acetilbromuro) è stato sviluppato e successivamente attaccato al polimero o rivestito sulla superficie dei nanogels. Inoltre, per condurre test in vitro sui nanogels, alcuni di essi sono stati anche legati a un tracciante come la rodamina ed il cy5-azide, il che ha permesso di studiare il loro percorso di internalizzazione. Tutti questi diversi nanogels sono stati quindi analizzati in termini di proprietà fisiche come il diametro idrodinamico e il potenziale zeta mediante analisi DLS, con l'obiettivo di studiarne la stabilità. Successivamente sono stati testati la citotossicità e l'attività antiossidante. Quest'ultima, indagata tramite test ORAC, si è rivelata efficace sia con i nanogels con il TEMPO graftato che con quelli rivestiti, permettendo di affermare che la molecola TEMPO preserva la sua capacità antiossidante quando caricata su un nanocarrier come i nanogels.