Opto-mechanical design and construction of a multimodal nonlinear optical microscope

Modern optical microscopes have redefined the boundaries of speed, resolution, and observable detail in biological specimens. The use of fluorescent labeling has further enhanced these capabilities, providing deep insights into molecular processes within living organisms. Multimodal nonlinear optical microscopy addresses the inherent limitations of conventional fluorescence-based techniques by employing a pulsed near-infrared laser. This method enables simultaneous acquisition of structural, chemical, and metabolic data without requiring external labeling. This thesis presents the design, construction, and testing of a multimodal nonlinear optical microscope capable of integrating several advanced imaging modalities, including two-photon excited fluorescence, second harmonic generation, stimulated Raman scattering, and coherent anti-Stokes Raman scattering. The project begins with a comprehensive analysis of the principles of microscopy and of the unique advantages brought by multiphoton and nonlinear modalities, such as their ability to penetrate deeper into tissues and generate contrast based on intrinsic molecular properties. The theoretical framework of nonlinear interactions, including third-order processes, forms the foundation for the subsequent design of the optical system. The opto-mechanical design of the microscope was carried out using CAD modeling to ensure precise alignment and optimization of the optical components. Key elements include an ultrafast picosecond laser source, a galvo mirror-based telecentric scanning system, and 3D-translation stages. Both trans- and epi-illumination detection elements are included in a multilevel configuration. In the construction phase, the assembled system underwent rigorous testing and calibration. The control software was developed in MATLAB, providing an intuitive interface for managing laser parameters, scanning operations, and multispectral image acquisition. System testing demonstrated the capability of the microscope to perform high-speed, high-resolution, multimodal imaging of plastic test samples. The results highlight the potential of this platform for applications in biomedical research, offering a powerful tool for studying live cells and tissues in their natural state.

I moderni microscopi ottici hanno ridefinito i confini della velocità, della risoluzione e dei dettagli osservabili nei campioni biologici. L’uso di fluorofori esogeni ha ulteriormente migliorato queste capacità, fornendo informazioni approfondite sui processi molecolari all’interno degli organismi viventi. La microscopia ottica multimodale non lineare affronta i limiti intrinseci delle tecniche convenzionali basate sulla fluorescenza utilizzando un laser impulsato nel vicino infrarosso. Questo metodo consente l’acquisizione simultanea di dati strutturali, chimici e metabolici senza bisogno di marcatori esterni. Questa tesi presenta la progettazione, la costruzione e il collaudo di un microscopio ottico non lineare multimodale in grado di integrare diverse modalità di imaging avanzate, tra cui la fluorescenza eccitata da due fotoni, la generazione di seconda armonica, il Raman scattering stimolato e il Raman scattering anti-Stokes coerente. Il progetto inizia con un’analisi completa dei principi della microscopia e dei vantaggi dei processi multifotonici e non lineari, come la loro capacità di penetrare più in profondità nei tessuti biologici e di generare un contrasto basato su proprietà molecolari intrinseche. Il quadro teorico delle interazioni non lineari, compresi i processi del terzo ordine, costituisce la base per la successiva progettazione del sistema ottico. La progettazione opto-meccanica del microscopio è stata eseguita utilizzando la modellazione CAD per garantire un allineamento preciso e l’ottimizzazione dei componenti ottici. Gli elementi chiave includono una sorgente laser ultraveloce a picosecondi, un sistema di scansione telecentrica basato su specchi galvanometrici, stage di traslazione 3D. Sia elementi di acqusizione in trans- e epi-illuminazione sono inclusi in una configurazione multilivello. Nella fase di costruzione, il sistema assemblato è stato sottoposto a rigorosi test e calibrazioni. Il software di controllo è stato sviluppato in MATLAB, fornendo un’interfaccia intuitiva per la gestione dei parametri laser, delle operazioni di scansione e dell’acquisizione di immagini multispettrali. I test del sistema hanno dimostrato la capacità del microscopio di eseguire immagini multimodali ad alta velocità e ad alta risoluzione di campioni di plastiche. I risultati evidenziano il potenziale di questa piattaforma per le applicazioni nella ricerca biomedica, offrendo un potente strumento per studiare cellule vive e tessuti nel loro stato naturale.