Combining light sheet fluorescent microscopy with photostimulation for dynamic studies

This thesis provides an in-depth exploration of Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM), from its historical development to practical applications, focusing on constructing an efficient LSFM system. Initially, the work covers the fundamental principles and step-by-step guide to building an LSFM setup, highlighting its advantages for non-invasive, high-resolution 3D imaging of biological samples. The study then advances into photostimulation, integrating a Digital Micromirror Device (DMD) to allow precise, targeted illumination for photoactivation of specific regions within the sample. The final sections demonstrate the versatility of LSFM through applications involving Arabidopsis thaliana and Hydra vulgaris. In Arabidopsis thaliana, LSFM reveals insights into calcium oscillations and growth in root hairs, showing differences between wild-type and mutant. The photostimulation capabilities of the system are utilized in the study of plants that express channelrhodopsin, providing a controlled method to study light-induced activation. Finally, the response of Hydra vulgaris to heat and infrared stimuli is analyzed, offering potential for future studies on neural adaptability and regenerative biology. Overall, this work not only serves as a guide to building and enhancing LSFM systems but also underscores the potential of LSFM to deepen our understanding of complex biological responses, setting a foundation for future innovations in live imaging and photostimulation research.

Questa tesi offre un’analisi approfondita della Ligth Sheet Fluorescent Microscopy (LSFM), tracciandone l’evoluzione storica e descrivendone le applicazioni pratiche, con un approfondimento sulla progettazione di un sistema LSFM. Nella prima parte, vengono presentati i principi fondamentali e una guida dettagliata alla costruzione di un setup LSFM, evidenziando i vantaggi di questa tecnica per l’imaging tridimensionale non invasivo e ad alta risoluzione di campioni biologici. Successivamente, lo studio esplora l’implementazione della fotostimolazione tramite l’integrazione di un Digital Micromirror Device (DMD), che consente un’illuminazione precisa per la fotoattivazione di specifiche aree del campione. Le sezioni finali mostrano la versatilità della LSFM attraverso applicazioni su Arabidopsis thaliana e Hydra vulgaris. Nei campioni di Arabidopsis thaliana, la LSFM è stata utilizzata per osservare le oscillazioni del calcio e la crescita dei peli radicali, mettendo in luce le differenze tra il wild type e i mutanti. Le capacità di fotostimolazione del sistema è stata utilizzata nello studio di piante che esprimono la channelrhodopsin, offrendo un metodo controllato per lo studio dell’attivazione indotta dalla luce. Infine, viene esaminata la risposta di Hydra vulgaris a stimoli termici e infrarossi, aprendo nuove prospettive per lo studio dell’adattabilità neurale e della biologia rigenerativa. Nel complesso, questo lavoro non solo funge da guida per la costruzione e l’ottimizzazione dei sistemi LSFM, ma ne evidenzia anche il potenziale per migliorare la comprensione delle risposte biologiche complesse, ponendo le basi per futuri sviluppi nella ricerca sull’imaging dal vivo e sulla fotostimolazione.