Development of multifunctional PEGylated fluorinated building blocks for the click-functionalization of gene delivery systems

Gene delivery is the process of introducing genetic material into cells using vectors to modify the cellular function or structure at molecular level. Non-viral delivery systems, such as cationic lipids and polymers, have emerged as alternatives to viral vectors but their therapeutic application remains limited due to their cytotoxic side effects. Among non-viral vectors, linear and branched polyethylenimines (lPEI and bPEI) and polyamidoamine (PAMAM) dendrimers are considered the golden standard. Specifically, PAMAM dendrimers are highly branched macromolecules with amine groups on the surface that can be employed in physiological conditions to interact with genetic material and promote internalization. However, the application of PAMAM is hindered by its cytotoxicity. A possible approach to overcome this issue is the conjugation with short polyethylene glycols (PEG), being PEG an inert, nonimmunogenic, and non-antigenic hydrophilic polymer. In this scenario, it has been reported that functional groups allow specific targeting ability and PEGylated PAMAM-mediated delivery enhances DNA transfection. In this work, we propose the functionalization of the outer primary amines of PAMAM G2 and PAMAM G4 with building blocks bearing fluorinated moieties along with a guanidino functional group. In fact, the use of fluorinated building blocks containing trifluoromethyl groups shows improved gene transfection efficiency. In addition, the presence of fluorine atoms enables analysis via 19F magnetic resonance imaging as fluorine exhibits no tissue background signal, allowing specific and selective assessment of the administrated fluorinated compounds in vivo. Functionalized dendrimers and dendriplexes are analyzed by Dynamic Light Scattering to gain information about their size. Furthermore, to study the selfassembling of dendrimers with plasmid DNA, gel electrophoresis analysis is performed.

Con “gene delivery” si intende il processo di introduzione di materiale genetico terapeutico all’interno delle cellule mediante specifici vettori al fine di correggere difetti genetici. I vettori non virali, tra cui vettori cationici lipidici e polimerici, costituiscono delle promettenti alternative ai vettori virali, ma la loro applicazione terapeutica rimane limitata a causa dei loro effetti citotossici. Tra i vettori non virali, le polietilenimmine lineari e ramificate (lPEI e bPEI) e i dendrimeri di poliammidoammina (PAMAM) sono considerati il gold standard. In particolare, i dendrimeri PAMAM sono macromolecole altamente ramificate con gruppi amminici terminali, che, essendo cationici in condizioni fisiologiche, possono essere sfruttati per interagire con materiale genetico anionico. Tuttavia, l’applicazione dei dendrimeri PAMAM è ostacolata dalla loro citotossicità. Un approccio possibile per aumentare la loro citocompatibilità è la coniugazione con corte catene di polietilenglicole (PEG), essendo il PEG un polimero idrofilo, inerte, non immunogenico e non antigenico. In questo contesto, studi hanno dimostrato che l’aggiunta di gruppi funzionali, come il gruppo guanidinico, consenta una maggiore capacità di internalizzazione e la somministrazione di PAMAM “PEGilato” migliori la sua efficienza di trasfezione. In questo lavoro, è stata svolta la funzionalizzazione dei gruppi amminici terminali del PAMAM G2 e PAMAM G4 con building blocks caratterizzati da un’estremità fluorurata, contenente un gruppo trifluorometilico e un doppio legame terminale, ed un gruppo guanidinico. Nello specifico, grazie alla loro elevata elettronegatività, gli atomi di fluoro conferiscono un’elevata reattività al doppio legame terminale, utile alla funzionalizzazione “click” del PAMAM, e consentono un’analisi tramite risonanza magnetica al fluoro grazie all’assenza di un segnale di background tissutale, permettendo così una valutazione specifica e selettiva dei dendriplessi una volta somministrati in vivo. I dendrimeri e dendriplessi funzionalizzati sono stati analizzati tramite Dynamic Light Scattering per ottenere informazioni sulle loro dimensioni e, per studiare la complessazione tra dendrimeri e DNA, un’analisi elettroforetica su gel è stata effettuata.