Optical scanning in dynamic remote focusing oblique light sheet microscopy

This Master Thesis presents the design and realization of a Dynamic Remote Focusing Oblique Plane Microscopy (RF-OPM) system with optical lateral scanning, aimed at achieving fast, high-resolution 3D imaging of biological specimens. RF-OPM combines the principles of oblique plane microscopy with remote focusing, allowing selective illumination of thin optical slices with reduced photobleaching and fast data acquisition rates, which are crucial for imaging live specimens over extended periods. In previous implementations of 3D imaging, datasets were acquired through mechanical scanning of the sample, often leading to longer acquisition times and potential distortions due to the mechanical movement. A significant advancement in this system is the integration of a Galvanometric Mirror for optical scanning, providing fast and precise angular control of the light path. This addition increases the system's flexibility and acquisition speed, enabling high temporal resolution and spatial coverage, particularly beneficial for dynamic live-sample imaging. Throughout this project, I contributed to the design and construction of the experimental setup, including the integration of the optical components and the Galvo-based lateral scanning system. Additionally, I took part in developing the software required for controlling the system and processing the resulting data. The performance of the system was validated by measuring various biological samples, demonstrating the capability of the RF-OPM setup to acquire high-quality 3D images with reduced acquisition time and minimal photobleaching.

La presente Tesi di Laurea Magistrale espone la progettazione e realizzazione di un sistema di Microscopia a Foglio di Luce Obliquo con Messa a Fuoco Remota Dinamica e scansione ottica laterale(RF-OPM), mirato a ottenere immagini tridimensionali di campioni biologici in maniera rapida e ad alta risoluzione. RF-OPM combina i principi della Microscopia a Piano Obliquo con la messa a fuoco remota, consentendo l'illuminazione selettiva di sottili sezioni ottiche con ridotta fototossicità e alta velocità di acquisizione dati, caratteristiche cruciali per l'imaging di campioni vivi per periodi prolungati. Nelle precedenti implementazioni del suddetto sistema, i dataset venivano acquisiti tramite scansione meccanica del campione, caratterizzata a tempi di acquisizione più lunghi e potenziali distorsioni dovute al movimento meccanico. Una significativa evoluzione è stata l'integrazione di uno Specchio Galvanometrico per la scansione ottica, che fornisce un controllo angolare del percorso della luce rapido e preciso. Questa evoluzione aumenta la flessibilità del sistema e la velocità di acquisizione, consentendo alta risoluzione temporale e copertura spaziale, particolarmente vantaggiosa per l'imaging di campioni dinamici in vivo. Durante questo progetto, ho contribuito alla progettazione e costruzione del setup sperimentale, inclusa l'integrazione dei componenti ottici e del sistema di scansione laterale basato sul Galvo. Inoltre, ho partecipato allo sviluppo del software necessario per il controllo del sistema e l'elaborazione dei dati risultanti. Le prestazioni del sistema sono state convalidate misurando vari campioni biologici, dimostrando la capacità del sistema RF-OPM di acquisire immagini 3D ad alta qualità con tempi di acquisizione ridotti e minimo fotodanneggiamento.