Time-resolved fluorescence spectroscopy for Non-Photochemical Quenching (NPQ) characterization of leaves

In the natural environment, plants face significant challenges in managing excess light, which can lead to photodamage if not carefully regulated. To cope with high light intensity, they employ Non-Photochemical Quenching (NPQ), a protective mechanism that safely dissipates excess energy as heat. Studying how plants control this energy dissipation is essential for understanding the effectiveness of photosynthetic systems and their resistance to environmental stress. One important way to measure this, is by looking the fluorescence lifetime of chlorophyll, which serves as a real-time indicator of how efficiently plants are managing light energy through NPQ. In this thesis, we have implemented a snapshot system that together with data analysis allows us to measure and quantify the fluorescence lifetimes. We use fluorescence lifetime measurements to track chlorophyll fluorescence dynamics under controlled light exposure, including periods of high-intensity light and darkness. This approach allows us to collect information on energy dissipation, offering a direct method to observe NPQ responses. By applying this technique to Arabidopsis thaliana and some of its mutants with modified light-harvesting complexes, we aim at understanding how different genotypes and specific protein complexes, especially those in Photosystem I (PSI) and Photosystem II (PSII), contribute to energy regulation. Through fluorescence measurements, we investigate the impact of these structural variations on NPQ efficiency and photoprotection. This study not only provides insight into the specific roles of PSI and PSII components but also demonstrates the efficacy of fluorescence lifetime spectroscopy as a powerful tool for analyzing plant adaptability under light stress. Our measurements of fluorescence lifetime in PSII and PSI mutants highlight the essential role of PSII in the regulation of non-photochemical quenching (NPQ). The fluorescence lifetime data suggest that PSII is primarily responsible for the initiation of NPQ, as it plays a key role in light absorption and energy dissipation. These findings reinforce the idea that PSII is critical for protecting the plant from excess light by efficiently dissipating energy through NPQ.

Nell'ambiente naturale, le piante affrontano sfide significative nella gestione della luce in eccesso, che può portare a fotodanno se non viene regolata correttamente. Per far fronte all'intensità luminosa elevata, le piante utilizzano il Quenching Non Fotochimico (NPQ), un meccanismo protettivo che dissipa in modo sicuro l'energia in eccesso come calore. Studiare come le piante controllano questa dissipazione energetica è essenziale per comprendere l'efficacia dei sistemi fotosintetici e la loro resistenza allo stress ambientale. Ciò è possibile misurando il tempo di vita di fluorescenza della clorofilla che funge da indicatore in tempo reale di quanto efficientemente le piante stiano gestendo l'energia luminosa attraverso il NPQ. In questa tesi, abbiamo implementato un sistema che, insieme all'analisi dei dati, ci consente di misurare e quantificare i tempi di vita della fluorescenza. In particolare utilizziamo le misurazioni del tempo di vita della fluorescenza clorofilla per monitorare i processi di NPQ sotto esposizione controllata alla luce quali periodi di luce ad alta intensità e di oscurità. Questo approccio ci consente di raccogliere informazioni sulla dissipazione dell'energia, offrendo un metodo diretto per osservare le risposte del NPQ. Applicando questa tecnica ad Arabidopsis thaliana e ad alcuni dei suoi mutanti con complessi di raccolta della luce modificati, miriamo a comprendere come diversi genotipi e specifici complessi proteici, in particolare quelli nel Fotosistema I (PSI) e nel Fotosistema II (PSII), contribuiscano alla regolazione dell'energia. Attraverso le misurazioni della fluorescenza, riusciamo a capire l'impatto di queste variazioni strutturali sull'efficienza del NPQ e sulla fotoprotezione. Questo studio non solo fornisce approfondimenti sui ruoli specifici dei componenti di PSI e PSII, ma dimostra anche l'efficacia della spettroscopia del tempo di vita della fluorescenza come uno strumento potente per analizzare l'adattabilità delle piante sotto lo stress luminoso. Le nostre misurazioni del tempo di vita della fluorescenza nei mutanti di PSII e PSI evidenziano il ruolo essenziale del PSII nella regolazione del quenching non fotochimico (NPQ). I dati del tempo di vita della fluorescenza suggeriscono che il PSII sia principalmente responsabile dell'inizio del NPQ, poiché svolge un ruolo chiave nell'assorbimento della luce e nella dissipazione dell'energia. Questi risultati rafforzano l'idea che il PSII sia fondamentale per proteggere la pianta dalla luce in eccesso, dissipando in modo efficente l'energia attraverso il NPQ.