Development and characterization of graphene-based nanoparticles for biomedical applications

A good control of the structure of graphene nanoparticles (GNPs) has been obtained by means of a protocol which makes use of physical treatments of high purity synthetic graphite to prepare reproducible batches of GNPs. Stable GNPs water dispersions are produced by means of ball-milling of synthetic graphite followed by sonication and centrifugation/separation procedures. The joint application of several characterization techniques, namely UV-vis absorption/extinction spectroscopy, Dynamic Light Scattering (DLS), Transmission Electron Microscopy (TEM), IR and Raman spectroscopies, shows that particles with small size can be obtained, with an average lateral size =70 - 120 nm, formed by few N = 1-10 stacked layers and with a small amount of carboxylic groups on the edges. These GNPs form stable water dispersions without the need of any surfactant, a property that makes them appealing in the perspective of biological and therapeutic applications and particularly for the development of drug delivery systems. Moreover, the thesis provides a critical reading and unified interpretation of a wide set of spectroscopic data. The potential of Specular Reflectance Infrared Spectroscopy for the diagnosis and quantification of chemical functionalization of GNPs is illustrated. Multi-wavelength Raman spectroscopy highlights features that are typical of a disordered solid-state crystalline material together with molecular features. The discussion of the Raman features exploits the analysis of the parameters obtained by curve fitting of the Raman spectra, which are useful for comparison and classification aims. Surface functionalization is an essential process to enable the use of graphene nanoparticles for biomedical purposes, and the modification of surfaces with specific targeting ligands is often necessary to reduce toxicity and increase stability and bioavailability. Starting from TOP60 and BOTTOM60 samples, I faced two different strategies for the preparation of GNPs conjugates: i. the R11@GNP conjugate is obtained by covalent grafting of a poly-arginine peptide-11 (R11) ii. the PyCA@GNP conjugate exploit π-π interactions of 1-pyrene-carboxylic acid with the graphene surface. R11@GNPs conjugates are characterized with UV-vis and IR spectroscopy, which prove the effectiveness of the covalent coupling. Moreover, evidences of the formation of π-π complexes between GNPs and 1-pyrene-carboxylic acid (PyCA@GNP) provide a first test of the drug loading capability of GNPs and of its thermal reversibility. The study of the fluorescence response of PyCA@GNPs conjugates allowed proving the upload of PyCA, which is revealed by fluorescence quenching because of π-π interactions: the fluorescence intensity of PyCA@B60 sample in water is remarkably lower than in the case of PyCA in water. By monitoring over time the fluorescence signal of PyCA@GNPs samples heated at 40 °C for 55 min, we demonstrated that it is possible to trigger the drug release with a thermal input at a rather low temperature. Meanwhile, the Raman spectra of functionalized GNPs (R11@GNP, PyCA@GNP conjugates) showed that their structure (disorder and/or size) has not changed after different degree of functionalization, which preserves their own chemical-physical properties. In addition, we present a study on these tailored GNPs, focusing on cytotoxicity, cellular up-take, and inflammatory response, by testing their effect in different cell lines. In this way, their low cytotoxicity has been proved, thus suggesting the potential application of this material in drug delivery systems.

Mediante un protocollo che fa uso di trattamenti fisici di grafite sintetica ad alta purezza, sono state preparate nanoparticelle di grafene (GNP) con un buon controllo della struttura e ottima riproducibilità. Mediante macinazione di grafite sintetica con mulino a palle, seguita da procedure di sonicazione e centrifugazione/separazione, sono state ottenute dispersioni di GNP stabili in acqua. L'applicazione congiunta di diverse tecniche di caratterizzazione, ovvero spettroscopia di assorbimento/estinzione UV-vis, Dynamic Light Scattering (DLS), microscopia elettronica a trasmissione (TEM), spettroscopia vibrazionale IR e Raman, mostra che è possibile ottenere particelle di piccole dimensioni, con una dimensione laterale media =70 - 120 nm, formate da pochi strati impilati N = 1-10 e con una piccola quantità di gruppi carbossilici sui bordi. Queste GNP formano dispersioni stabili in acqua senza la necessità di alcun tensioattivo, una proprietà che le rende interessanti nella prospettiva di applicazioni biologiche e terapeutiche e in particolare per lo sviluppo di sistemi di somministrazione di farmaci. Inoltre, la tesi fornisce una lettura critica e un'interpretazione unificata di un ampio set di dati spettroscopici. Viene illustrato il potenziale della spettroscopia infrarossa in riflessione speculare per la diagnosi e la quantificazione della funzionalizzazione chimica dei GNP. La spettroscopia Raman a diverse lunghezze d’onda evidenzia caratteristiche tipiche di un materiale cristallino contenente parziale disordine e caratterizzato da alcune caratteristiche molecolari. La discussione delle caratteristiche Raman sfrutta l'analisi dei parametri ottenuti per mezzo di “curve fitting” degli spettri Raman, che sono utili per scopi di confronto e classificazione. La funzionalizzazione della superficie è un processo essenziale per consentire l'uso di nanoparticelle di grafene per scopi biomedici e la modifica delle superfici con specifici ligandi è spesso necessaria per ridurre la tossicità e aumentare la stabilità e la biodisponibilità. Partendo da campioni TOP60 e BOTTOM60, ho affrontato due diverse strategie per la preparazione di coniugati di GNP: i. il coniugato R11@GNP è ottenuto tramite innesto covalente di un peptide-11 di poli-arginina (R11) ii. il coniugato PyCA@GNP sfrutta le interazioni π-π dell'acido 1-pirene-carbossilico con la superficie del grafene. I coniugati R11@GNP sono caratterizzati con spettroscopia UV-vis e IR che dimostrano l'efficacia dell'accoppiamento covalente. Inoltre, le prove della formazione di complessi π-π tra GNP e acido 1-pirene-carbossilico (PyCA@GNP) forniscono un primo test della possibilità di caricamento del farmaco sulle GNP e della sua reversibilità termica. Lo studio della risposta di fluorescenza dei coniugati PyCA@GNP ha permesso di dimostrare il caricamento di PyCA, che viene rivelato dall'estinzione della fluorescenza a causa delle interazioni π-π: l'intensità di fluorescenza del campione PyCA@B60 in acqua è notevolmente inferiore rispetto al caso di PyCA in acqua. Monitorando nel tempo il segnale di fluorescenza dei campioni PyCA@GNP riscaldati a 40 °C per 55 min, abbiamo dimostrato che è possibile innescare il rilascio del farmaco con un input termico a una temperatura piuttosto bassa. Nel frattempo, gli spettri Raman dei GNP funzionalizzati (coniugati R11@GNP, PyCA@GNP) hanno mostrato che la loro struttura (disordine e/o dimensione) non è cambiata dopo diversi gradi di funzionalizzazione, il che preserva le loro proprietà chimico-fisiche. Inoltre, presentiamo uno studio su questi GNP su misura, focalizzato sulla citotossicità, l'assorbimento cellulare e la risposta infiammatoria, testandone l'effetto in diverse linee cellulari. La dimostrazione della loro bassa citotossicità, suggerisce la potenziale applicazione di questo materiale nei sistemi di somministrazione di farmaci.