A novel Fourier transform hyperspectral system for multimodal wide-field Raman microscopy

Since the 1970s Hyperspectral Imaging (HSI) has proved to be a powerful technique to study the materials in a non-invasive way by detecting the light reflected, transmitted, scattered or emitted by the target sample. This technology, which combines two-dimensional spatial imaging with the spectral information retrieved by a spectrometer and whose applications nowadays span from large Field-of-View (FOV) to microscopy, provides a wealth of information to characterize the matter according to its optical properties. The spectrometers exploited in HSI are of two types: dispersive spectrometers, which spatially separate the different light’s wavelengths, and Fourier Transform (FT) spectrometers, which measure the light’s interferogram and retrieve the related spectrum through the FT operation. Despite FT spectroscopy offers prominent advantages for HSI applications over the dispersive techniques in terms of spectral accuracy, measurement times and interferogram’s sampling strategies for suitable spectral features’ selection, its applications are limited only to the long-wavelength spectral ranges, e.g. IR, due to the intrinsic instability of interferometers. A prominent field of the HSI is the Raman microscopy, a technique which typically combines a point-scanning mapping of the sample with a pump laser in the visible (VIS) or near-IR (NIR) spectral range and a dispersive spectrometer that measures the Spontaneous Raman vibrational modes of detected molecules. Due to its high chemical specificity such technique is nowadays applied in many research fields such as material science, biology and medicine. Nevertheless, due to the intrinsic inefficiency of the Raman process, it ends up in long measurement times (∼ 10 hours for 10^5 pixels image) which limit a real exploitation for routine research applications. Moreover, another limitation of Raman measurements is the broadband fluorescence background which hinders or even overwhelms the detection of vibrational peaks of interest. In my PhD I developed a novel FT Raman hyperspectral microscope (HSM) based on an innovative interferometer, the TWINS, introduced in 2012 by Brida, Manzoni and Cerullo, which overcomes the typical limitations of Raman microscopy. In fact, the combination of the FT approach with the unique long-term stability of TWINS (better than 1/360 of the optical cycle in the VIS and UV spectral ranges) makes this microscope suitable for widefield Raman HSI with high spatial (∼ 1µm) and spectral (∼ 23cm−1) resolution, high Raman-shift accuracy (< 1cm−1) and short measurement times (∼ 10 minutes for 10^5 pixels image). Moreover, the FT approach allows to disentangle Raman and fluorescence signals allowing sequential and separated multimodal measurements of the same FOV. Beside the design, alignment and calibration of such an instrument, I implemented a proper denoising, data processing and spectral analysis of the measured FT hyperspectral datasets. I validated the FT Raman microscope by detecting plastic microbeads (∼ 10µm diameter) and showed its multimodal application by measuring sequential fluorescence and Raman maps of a multi-layer WSe2 sample. Then the FT Raman HSM has been exploited to detect microplastics filtered from seawater samples, outlining a promising application in environmental microplastics’ pollution monitoring. Finally, I demonstrated a measurement protocol to enhance the performances of FT HSI systems in terms of choice of illumination source and detector’s acquisition.

Dagli anni ’70, l’Imaging Iperspettrale (HSI) si è dimostrato una potente tecnica per studiare i materiali in modo non invasivo, misurando la luce riflessa, trasmessa, diffusa o emessa dal campione da analizzare. Questa tecnologia, che combina l’imaging spaziale bidimensionale con le informazioni spettrali fornite da uno spettrometro e le cui applicazioni oggi spaziano dall’acquisizione di ampi campi di vista (FOV) fino alla microscopia, fornisce un’ampia quantità di informazioni per caratterizzare la materia in base alle sue proprietà ottiche. Gli spettrometri utilizzati nell’HSI sono di due tipi: spettrometri dispersivi, che separano spazialmente le diverse lunghezze d’onda della luce, e spettrometri a Trasformata di Fourier (FT), che misurano l’interferogramma della luce e ne ricavano lo spettro tramite l’operazione di FT. Sebbene la spettroscopia FT offra vantaggi significativi per le applicazioni HSI rispetto alle tecniche dispersive, in termini di accuratezza spettrale, tempi di misura e strategie di campionamento dell’interferogramma per un’opportuna selezione di caratteristiche spettrali di interesse, le sue applicazioni sono limitate a intervalli spettrali di lunghezze d’onda lunghe, ad esempio nell’infrarosso (IR), a causa dell’instabilità intrinseca degli interferometri. Un settore di grande rilievo nell’HSI è la microscopia Raman, una tecnica che tipicamente combina una mappatura punto per punto del campione con un laser di eccitazione nel visibile (VIS) o nel vicino infrarosso (NIR) e uno spettrometro dispersivo che misura i modi vibrazionali Raman delle molecole rilevate. Grazie alla sua elevata specificità chimica, questa tecnica è oggi applicata in numerosi ambiti di ricerca, come la scienza dei materiali, la biologia e la medicina. Tuttavia, a causa dell’inefficienza intrinseca del processo Raman, i tempi di misura risultano lunghi (∼ 10 ore per immagini da 10^5 pixel), limitando l’utilizzo per applicazioni di ricerca di routine. Inoltre, un’ulteriore limitazione delle misure Raman è rappresentata dal fondo di fluorescenza a banda larga, che ostacola o addirittura sovrasta la rilevazione dei picchi vibrazionali di interesse. Nel mio dottorato di ricerca ho sviluppato un nuovo microscopio iperspettrale Raman FT (HSM) basato su un innovativo interferometro, il TWINS, introdotto nel 2012 da Brida, Manzoni e Cerullo, che supera le tipiche limitazioni della microscopia Raman. Infatti, la combinazione dell’approccio FT con l’eccezionale stabilità a lungo termine del TWINS (migliore di 1/360 del ciclo ottico nei range spettrali VIS e UV) rende questo microscopio adatto all’HSI Raman a campo largo, con elevata risoluzione spaziale (∼ 1µm) e spettrale (∼ 23cm−1), alta accuratezza dello shift Raman (< 1cm−1) e tempi di misura ridotti (∼ 10 minuti per immagini da 10^5 pixel). Inoltre, l’approccio FT permette di separare i segnali Raman e di fluorescenza, consentendo misure multimodali sequenziali e distinte dello stesso FOV. Oltre alla progettazione, all’allineamento e alla calibrazione di questo strumento, ho implementato un adeguato processo di denoising, elaborazione dati e analisi spettrale dei dataset iperspettrali FT acquisiti. Ho validato il microscopio Raman FT rilevando microsfere di plastica (∼ 10µm di diametro) e ne ho dimostrato l’applicazione multimodale misurando mappe di fluorescenza e Raman sequenziali di un campione multistrato di WSe2. Successivamente, il microscopio Raman FT è stato impiegato per rilevare microplastiche filtrate da campioni di acqua di mare, evidenziando una promettente applicazione nel monitoraggio dell’inquinamento ambientale da microplastiche. Infine, ho dimostrato un protocollo di misura per migliorare le prestazioni dei sistemi FT HSI in termini di scelta della sorgente di illuminazione e dell’acquisizione del rivelatore.